中性粒细胞分泌蛋白常于草酸钙（CaOx）肾结石基质中被检出，提示其参与结石发病，但机制不明。因此研究人员以经CaOx一水合物（COM）暴露及对照处理的人中性粒细胞样（dHL-60）细胞之分泌组（secretome，分泌蛋白集合）为对象，考察其对COM晶体成核（结晶）、生长、聚集及侵袭之影响，并行定量蛋白质组学鉴定显著差异分泌蛋白并分析其理化性质与生物学意义。结果显示，COM处理组与对照组分泌组均抑制结晶与晶体生长，但COM处理组分泌组抑制作用略弱；反之，两组均促进晶体聚集，且COM处理组分泌组促聚集作用更强；两组对晶体侵袭均无调节作用。定量蛋白质组学示COM处理组分泌组较对照组含20种下调及9种上调蛋白；上调分泌蛋白具较低不稳定指数及较少草酸结合基序/蛋白，主要功能为催化、水解酶及转运活性，下调组则具RNA结合、分子衔接及催化活性。结果表明中性粒细胞分泌组抑制结晶与晶体生长而促进晶体聚集，COM激活后分泌组对结晶与生长抑制减弱但对聚集促进增强，增进了对中性粒细胞在肾结石发病中作用之认识。
论文解读——《Neutrophil Secretory Proteins Inhibit Calcium Oxalate Crystallisation and Crystal Growth, but Promote Crystal Aggregation》（发表于Immunology）
肾结石病（kidney stone disease）以晶体与有机质在肾内沉积为特征，全球患病率约10%，其中70%–80%为草酸钙（Calcium Oxalate, CaOx）结石，尤以草酸钙一水合物（Calcium Oxalate Monohydrate, COM）最常见。结石形成关键步骤包括结晶（成核）、晶体生长、晶体聚集及晶体侵袭（crystal invasion/translocation），受尿中过饱和状态及结石调节蛋白失衡驱动。Randall斑为常见起始事件，但炎症细胞在结石进展中的作用渐受关注。中性粒细胞作为首要防御性白细胞，可被COM晶体激活并发生脱颗粒（degranulation），释放嗜天青颗粒、特异性颗粒等所含蛋白至胞外，且髓过氧化物酶（myeloperoxidase）、乳铁蛋白（lactoferrin）、防御素（defensin）等中性粒细胞颗粒蛋白已被证实存在于CaOx结石基质中，提示中性粒细胞分泌蛋白参与结石发病，但其具体调控结晶各步骤之机制尚属未知。本研究以此为切入点，利用人早幼粒白血病细胞系HL-60经二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO）诱导分化所得之人中性粒细胞样细胞（differentiated HL-60, dHL-60），收集对照组及COM晶体暴露组之分泌组（secretome），系统评估其对COM晶体成核（结晶）、生长、聚集及肾小管基底膜侵袭之双向调节作用，并结合无标记定量蛋白质组学（label-free quantitative proteomics）解析COM刺激后分泌蛋白谱变化及其理化特征，阐明中性粒细胞在CaOx结石形成中之双重作用。
研究人员采用如下主要关键技术方法：以ATCC来源HL-60细胞经1.25% DMSO诱导6 d分化为dHL-60中性粒细胞样细胞；以经典方法合成COM晶体；dHL-60细胞分别于无血清RPMI 1640中不加（对照）或加100 μg/mL COM晶体孵育2 h（经流式细胞术Annexin V/PI检测确定该时间点无显著细胞死亡），收集上清获对照分泌组与COM处理分泌组，透析除盐冻干后复溶并统一蛋白浓度至1 μg/μL；进行COM结晶（crystallisation/nucleation）检测、晶体生长（crystal growth）检测（测Δ晶体粒径及生长抑制率）、晶体聚集（crystal aggregation）检测（计每视野聚集体数）及Transwell式晶体侵袭（crystal invasion）检测；取30 μg分泌组样品行溶液内胰酶消化后经nanoLC-ESI-Qq-TOF MS/MS进行无标记定量蛋白质组学鉴定差异分泌蛋白（上调/下调以fold change显著变化为准）；Western blot验证差异蛋白（亲环蛋白A/cyclophilin A及α-烯醇化酶α-enolase）；利用Expasy ProtParam计算等电点（isoelectric point, pI）与不稳定指数（instability index），OxaBIND工具预测草酸结合基序（oxalate-binding motif），UniProt查钙结合位点，ShyniGO行Reactome通路富集分析。
3.1 Optimal Time-Point for the Secretome Collection
研究人员将dHL-60细胞分别在无COM及含100 μg/mL COM条件下孵育2、4、6、8、10 h，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞死亡率。结果显示无COM组各时间点死亡率无明显变化，COM组自4 h起死亡率渐升；2 h时两组细胞死亡率均无显著增加，故选定2 h为分泌组收集最佳时间点，可排除细胞死亡裂解释放胞内蛋白之污染。
3.2 Effect of Control Versus COM-Treated Secretome on Crystallisation
研究人员向结晶体系分别加入对照分泌组、COM处理分泌组或空白缓冲液，镜下观察并计量晶体尺寸与丰度。结果显示两分泌组均使COM晶体尺寸减小、数量减少（vs空白对照），且对照分泌组抑制结晶作用强于COM处理分泌组，表明两分泌组均抑制COM成核/结晶，未受COM刺激的中性粒细胞分泌组抑制效应更强。
3.3 Effect of Control Versus COM-Treated Secretome on Crystal Growth
研究人员向预置COM晶体的生长体系中加入分泌组，测定T0与T60 min晶体粒径差（Δ crystal size）及晶体生长抑制百分率。结果显示两分泌组均减小Δ crystal size、提高生长抑制率（vs空白对照），对照分泌组抑制率更高，证实两分泌组均抑制COM晶体生长，对照分泌组抑制效应更强。
3.4 Effect of Control Versus COM-Treated Secretome on Crystal Aggregation
研究人员向COM晶体悬液加入分泌组，计数每视野晶体聚集体（aggregate）数目。结果显示两分泌组均增加聚集体数（vs空白对照），COM处理分泌组促聚集作用更显著，表明中性粒细胞分泌组促进COM晶体聚集，COM激活后此促聚集效应增强。
3.5 Effect of Control Versus COM-Treated Secretome on Crystal Invasion
研究人员利用包被细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）之Transwell小室进行晶体侵袭实验，以白蛋白（albumin）为正对照、溶菌酶（lysozyme）为负对照。结果显示仅白蛋白组促进晶体穿透ECM之距离，对照分泌组、COM处理分泌组、负对照及空白对照均无调节作用，说明中性粒细胞分泌组不影响COM晶体侵袭肾小管基底膜。
3.6 Quantitative Proteomics to Identify Significantly Altered Secretory Proteins From dHL-60 Cells After COM Crystal Exposure
研究人员对两分泌组行Label-free LC-MS/MS定量蛋白质组学，共鉴定235种蛋白（含髓过氧化物酶、溶菌酶C、S100A8、S100A9等典型中性粒细胞颗粒/分泌蛋白），其中COM处理组相对对照组有20种显著下调、9种显著上调（如上调：亲环蛋白A/PPIA fold-change 1.54、S100A8 1.27、结合珠蛋白/haptoglobin 2.09等；下调：α-烯醇化酶/ENO1 0.73等）。Western blot验证PPIA上调及ENO1下调，与质谱结果吻合。
3.7 Physicochemical Properties and Biological Relevance of Significantly Altered Secretory Proteins
研究人员分析差异蛋白理化性质：上调与下调组间等电点（pI≈5.99中位）及酸/碱性蛋白比例无差异；但上调组具更低不稳定指数（instability index），稳定蛋白（index＜40）比例更高；OxaBIND分析示上调组草酸结合基序/蛋白数更少、具草酸结合能力之蛋白比例更低；钙结合位点/蛋白比例两组无差异。GO功能注释：上调蛋白主司催化、水解酶及转运活性，参与细胞分化与解剖结构发育，定位于细胞器及胞外空间；下调蛋白主司RNA结合、分子衔接（adaptor）及催化活性，参与信号转导、程序性细胞死亡及分化，定位于胞外空间及胞质。Reactome富集示中性粒细胞脱颗粒（neutrophil degranulation）、免疫系统活化及代谢适应通路显著富集。
讨论与结论总结
讨论指出中性粒细胞颗粒蛋白（如髓过氧化物酶、防御素、乳铁蛋白）已在CaOx结石基质中被发现，本研究首次系统揭示中性粒细胞分泌组对COM结石形成多步骤之双向调节：通过带负电蛋白之胶体稳定效应（占据预成核簇/pre-nucleation clusters, PNCs表面产生静电排斥）及草酸结合蛋白螯合C2O42−离子降低过饱和度，抑制结晶与生长；对照分泌组中不稳定蛋白（易自剪切产短肽）及草酸结合蛋白比例更高，故抑制效应更强。聚集促进符合"桥联聚集（bridging aggregation）"模型——分泌蛋白部分覆盖带相反电荷之COM晶体表面产生电荷斑（charge patch），与邻近裸晶面静电吸引致聚集，COM刺激后上调之S100A8/A9（钙保护蛋白calprotectin）及亲环蛋白A（cyclophilin A, PPIA）可能作为交联剂（cross-linker）增强此效应。研究局限含使用dHL-60而非原代中性粒细胞、COM微溶致微量Ca2+可能影响、体外无血清培养基未模拟尿液微环境。最终结论为：对照与COM处理中性粒细胞样细胞分泌组均抑制COM结晶与晶体生长（COM处理组较弱），均促进COM晶体聚集（COM处理组较强），两者均不调控晶体侵袭；COM刺激致分泌组中20种蛋白下调、9种上调，上调蛋白具更低不稳定指数与更少草酸结合基序，主要功能为催化/水解酶/转运活性；该发现深化了对中性粒细胞在肾结石发病机制中角色的理解。
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