生物杀灭剂(biocides)被广泛用于控制不必要的生物生长。异噻唑啉酮类(isothiazolinone)生物杀灭剂是用于稳定各类产品以抵抗微生物污染和降解的一类药物。尽管此类生物杀灭剂被认为不太可能诱导产生耐药性(resistance)，但本研究描述了一种能够解毒常用异噻唑啉酮类生物杀灭剂MIT/CMIT（2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮）的系统。该系统发现于污染含异噻唑啉酮作为防腐剂的市售液体皂的产酸克雷伯菌复合群(Klebsiella oxytoca complex)细菌中。该分离株通过质粒编码的谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase)系统催化的谷胱甘肽(glutathione, GSH)依赖性反应使MIT/CMIT失活。该系统包含一个谷胱甘肽转移酶基因(gstA)和一个羟酰基谷胱甘肽水解酶基因(gloB)，二者位于约80 kbp质粒上的一个操纵子(operon)内，并与砷抗性(arsenic resistance)盒(cassette)共定位。该质粒可通过接合(conjugation)转移至大肠埃希菌(Escherichia coli)。研究结果表明，扩大生物杀灭剂的使用会日益驱动不同耐药机制(evolved resistance mechanisms)的出现、选择和传播，这一风险值得关注。
论文解读：质粒编码谷胱甘肽依赖解毒系统介导Klebsiella oxytoca complex对异噻唑啉酮类杀菌剂MIT/CMIT的耐药
一、研究背景与目的
异噻唑啉酮类杀菌剂MIT/CMIT（2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮）广泛用作个人护理品、燃料及体外诊断试剂中的防腐剂(preservative)，典型商品名为Kathon和ProClin。MIT/CMIT通过亲核攻击必需酶的巯基(thiol group)——特别是影响三羧酸(TCA/Krebs)循环中的丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)、α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)和NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)——发挥杀菌作用。由于多靶点作用模式，大多数细菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)低于1 mg/L，且业界曾认为其不易产生耐药。然而2013年常规监测发现，含MIT/CMIT作防腐剂的市售液体皂被产酸克雷伯菌复合群(Klebsiella oxytoca complex)污染（>104CFU/mL），分离株MIC达2–8 mg/L，高于一般敏感菌株（≈1 mg/L）。目前尚无明确的MIT/CMIT特异性酶促解毒耐药机制被报道。本研究旨在鉴定导致该表型的遗传决定簇，并评估其可移动性。本文发表于《Applied and Environmental Microbiology》。
二、主要关键技术方法
研究人员从同一批次受污染的两种瓶装液体皂中分离获得10株Klebsiella oxytoca complex临床分离株（PHS-890至PHS-899），以标准参考株K. oxytoca ATCC13182、K. pneumoniae DSM12082及Escherichia coli MG1655/TOP10为对照。采用微量肉汤稀释法测定MIT/CMIT的MIC；通过碱裂解法结合脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)分析质粒谱；对携带80 kbp质粒的PHS-894进行PacBio单分子实时测序(PacBio RS sequencing)注释质粒基因组；开展接合转移(conjugation)实验将质粒从PHS-894转移至E. coli TOP10筛选转接合子(transconjugant)；通过PCR及克隆将质粒上砷抗性操纵子(ars operon, arsAB)及谷胱甘肽操纵子(gstA-gloB)分别亚克隆至pUC19载体，转化E. coli感受态细胞，利用琼脂扩散试验(agar diffusion test)和MIC测定评估各基因元件对MIT/CMIT、锑(sb, antimony(III) potassium tartrate)及苯并异噻唑啉酮(benzisothiazolinone, BIT)敏感性的影响；另将gstA-gloB导入谷胱甘肽合成缺陷株E. coli ΔgshA(KEIO集合)验证GSH依赖性；在含MIT/CMIT的原品牌液体皂及LB培养基中进行存活动力学测试。
三、研究结果
Isolates with reduced MIT/CMIT susceptibility all contain an 80-kbp plasmid（具MIT/CMIT敏感性降低的分离株均含有80 kbp质粒）
质粒谱分析显示，6株MIC=8 mg/L的肥皂分离株均携带约80 kbp质粒，而4株MIC≈2 mg/L的分离株不含此质粒。含80 kbp质粒的分离株可在含MIT/CMIT原品牌液体皂中存活>20天（仅下降约1 log10CFU/mL），而无此质粒的分离株及敏感参考株ATCC13182在15天内被完全杀灭；在LB中，带质粒分离株可在≤3.8 mg/L MIT/CMIT中生长，无质粒株在1.9 mg/L下2日内死亡。琼脂扩散试验中带质粒株抑制圈直径显著缩小（18–20 mm vs. 24–28 mm）。结论：80 kbp质粒与MIT/CMIT MIC升高及在含杀菌剂产品中存活能力密切相关。
Horizontal transfer of the MIT/CMIT resistance determinant to recipient Escherichia coli（MIT/CMIT耐药决定簇可向大肠埃希菌受体水平转移）
以PHS-894为供体、链霉素抗性E. coli TOP10为受体进行接合实验，筛选出同时抗链霉素和MIT/CMIT的转接合子。转接合子MIC由亲本TOP10的1 mg/L升至4–5.3 mg/L，并检出80 kbp质粒。结论：该MIT/CMIT解毒系统位于可接合转移的质粒上，具有种间水平传播能力。
Plasmid characterization（质粒特征与功能基因鉴定）
PacBio测序表明80 kbp质粒含砷抗性ars操纵子（arsB编码ABC型外排泵），但克隆ars操纵子仅赋予锑抗性而对MIT/CMIT敏感性无影响，排除arsB参与MIT/CMIT耐药。进一步发现质粒携带谷胱甘肽转移酶基因(gstA)与羟酰基谷胱甘肽水解酶基因(gloB)组成的操纵子（谷胱甘肽操纵子），将其克隆至pUC19转化E. coli 10β后，MIT/CMIT的MIC提高约8倍，锑敏感性不变；该操纵子不降低对结构类似物BIT的敏感性。将此操纵子导入ΔgshA（谷胱甘肽合成缺陷）菌株后，无法降低MIT/CMIT敏感性，证实解毒反应严格依赖胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)。结论：质粒编码的GstA-GloB双酶系统以GSH依赖方式催化MIT/CMIT共轭解毒，是介导MIC升高的唯一决定因子。
四、讨论与结论总结
此前报道的MIT/CMIT低敏多涉及复杂多基因适应（如Pseudomonas aeruginosa中ABC转运蛋白外排或硫代谢酶差异表达），尚无明确的单一酶促解毒操纵子被鉴定。本研究首次阐明一个质粒编码的gstA-gloB操纵子通过GSH依赖的共轭反应使MIT/CMIT失活，从而赋予Klebsiella oxytoca complex对MIT/CMIT的遗传编码性耐药（MIC由2 mg/L升至8 mg/L），且该质粒可通过接合在菌种间传播。值得注意的是，gstA-gloB与ars操纵子共定位于同一可移动遗传元件(mobile genetic element, MGE)，暴露于MIT/CMIT或砷/锑均可共选择(co-selection)两种抗性系统。解毒系统对BIT无交叉作用，提示底物特异性。机会致病菌Klebsiella在含杀菌剂皂液中的存活提示被污染日化产品可成为耐药质粒及病原菌的传播源，对公共卫生构成潜在威胁。研究强调广泛大量使用生物杀灭剂可促进特异性酶促解毒耐药机制的出现、演化与水平扩散。
综上，研究人员发现并证实了产酸克雷伯菌复合群污染含MIT/CMIT液体皂的成因系一约81.8 kbp接合质粒上gstA-gloB操纵子编码的谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)与羟酰基谷胱甘肽水解酶(hydroxyacylglutathione hydrolase, GloB)介导GSH依赖的MIT/CMIT酶促解毒，该质粒可与砷抗性操纵子共选择并通过接合在不同肠杆菌科细菌间水平转移，揭示了异噻唑啉酮类杀菌剂使用压力下可移动耐药决定簇的产生与扩散风险。
