产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase, ESBL)和碳青霉烯酶的克雷伯菌属细菌，尤其是肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），在临床和社区环境中均构成日益严重的威胁。为调查牛源菌株的流行病学、系统发育和抗菌药物耐药性，研究人员从河南省8个奶牛场的180份乳腺炎乳样中分离获得174株细菌。经鉴定，65株为克雷伯菌属，包括61株肺炎克雷伯菌、2株类肺炎克雷伯菌（K. quasipneumoniae）、1株产酸克雷伯菌（K. oxytoca）和1株密歇根克雷伯菌（K. michiganensis）。系统发育分析将大多数菌株归属为KpI系统发育群，多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST)揭示24种序列型（Sequence Types, STs），以ST107和ST1083为主。基于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP)的系统发育提示存在两个主要克隆分支且有克隆传播证据。与人类高毒力参考菌株相比，牛源菌株在遗传上明显不同，缺乏关键毒力基因rmpA、iuc和iro，仅少数菌株携带ybt。在65株克雷伯菌分离株中，31株（47.7%）为ESBL产酶株，主要携带blaCTX-M-3或blaCTX-M-15，1株肺炎克雷伯菌携带碳青霉烯酶编码基因blaNDM-1。ESBL产酶株对β-内酰胺类抗生素的耐药率超过90%，但对环丙沙星和庆大霉素基本敏感，87.1%表现为多重耐药（Multidrug Resistance, MDR）。研究人员观察到多种耐药和毒力决定因子的共存，blaCTX-M基因的播散与移动元件ISEcp1密切相关。质粒分析显示blaCTX-M基因主要定位于IncFIB(K)质粒，而blaNDM-1阳性菌株携带可转移的IncC2质粒。SNP分析进一步支持相同ST菌株间的克隆传播。这些发现表明奶牛是多药耐药克雷伯菌的重要储存库，耐药性由克隆传播和质粒介导的水平转移共同驱动，对动物健康、抗菌药物管理和人畜共患传播构成潜在风险。
该研究发表于《Transboundary and Emerging Diseases》期刊，旨在揭示中国河南省奶牛乳腺炎中blaCTX-M和blaNDM产酶型克雷伯菌属细菌的流行态势与分子传播机制，为防控耐药菌传播提供科学依据。
**一、研究背景与问题提出**
抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR)的迅速出现和播散已成为全球性公共卫生挑战，尤其在农业环境中表现突出。乳腺炎是奶牛常见疾病，不仅造成重大经济损失，还因耐药菌的传播而威胁公共卫生安全。克雷伯菌属作为乳腺炎的重要机会性病原体，其耐药性问题日益受到关注。世界卫生组织（World Health Organization, WHO)将肺炎克雷伯菌列为第三大关键优先病原体，仅次于大肠埃希菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。值得关注的是，超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶的产生是耐药菌株的核心特征，其中blaCTX-M基因编码的超广谱β-内酰胺酶可赋予菌株对头孢菌素的耐药性，而blaNDM介导的碳青霉烯酶则使菌株对"最后防线"抗生素产生抗性。
在奶牛养殖领域，虽然良好的饲养管理和挤奶卫生是预防乳腺炎的主要策略，但第三代头孢菌素（如头孢噻呋）的使用仍十分普遍。然而，许多此类抗生素被WHO列为AWaRe分类中的"储备"（Reserve)类药物，其在畜禽中的广泛使用加剧了ESBL和碳青霉烯酶产生菌的流行。现有研究表明，奶牛场可作为耐药病原菌的重要储存库，但针对牛源肺炎克雷伯菌的系统研究仍相对匮乏，特别是其分子流行病学特征和传播机制尚待深入阐明。因此，开展针对中国河南省奶牛乳腺炎中blaCTX-M和blaNDM产酶型克雷伯菌的流行病学调查，对于制定精准的防控策略具有重要意义。
**二、关键技术方法**
研究人员从河南省8个奶牛场的180份临床乳腺炎乳样中采集样本，经16S rRNA基因测序鉴定菌株；采用PCR扩增检测耐药基因；通过微量肉汤稀释法测定14种抗菌药物的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC)；利用接合转移实验验证blaNDM-1基因的可转移性；采用Illumina HiSeq 2000平台进行全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS），对blaNDM-1阳性菌株额外进行Oxford Nanopore Technologies MinION平台长读长测序；运用Unicycler进行杂合组装，通过ResFinder、PlasmidFinder、ISfinder、MOB-suite、Kleborate、Kaptive等生物信息学工具进行耐药基因、质粒复制子类型、插入序列、毒力因子及荚膜脂多糖分型分析；基于Roary提取的核心基因组SNP构建系统发育树，采用Snippy流程进行变异检测，并通过Gephi构建耐药基因与插入序列的共现网络。
**三、研究结果**
**3.1 65株克雷伯菌的基因型特征**
从180份乳样中分离获得192株细菌，其中65株为克雷伯菌属。PCR分析显示，blaCTX-M、tet(A)和floR基因的检出率分别为47.7%（31/65）、46.2%（30/65）和35.4%（23/65），blaNDM-1仅检出1株（1.5%）。在31株ESBL产酶株中，80.6%携带两种及以上β-内酰胺酶基因，主要为blaCTX-M和blaTEM。blaCTX-M家族中以blaCTX-M-1群为主，进一步亚型分析显示blaCTX-M-3和blaCTX-M-15为优势变体，blaCTX-M-9群主要为blaCTX-M-14和blaCTX-M-27。
基于gyrA基因序列分析，61株肺炎克雷伯菌和2株类肺炎克雷伯菌被归属为KpI和KpII系统发育群，93.8%（61/65）属于KpI。MLST将61株KpI型肺炎克雷伯菌分为24种ST，以ST107和ST1083（各6株）为主，还包括ST37和ST716（各5株）等优势类型。Kleborate分析鉴定出23种荚膜位点（K-locus, KL)类型，以KL132（11.5%）、KL114、KL110和KL101（各9.8%）最为常见。O抗原分为6种类型，O1型占47.5%居首位。
**3.2 61株牛源肺炎克雷伯菌的系统发育分析**
基于SNP的系统发育分析揭示两个主要分支（Clade I和Clade II）。Clade I包含与ST107和ST219等相关的菌株，这些优势ST亚群SNP差异仅为0–3，提示克隆扩张；Clade II包括与ST37和ST1083等相关的菌株，内部多样性更高。与人类高毒力参考菌株相比，牛源菌株在系统发育树上属于明显不同的分支，核心基因组SNP差异约25,000。在毒力基因分布方面，高毒力ST23型NTUH-K2044携带ybt2、iro3和rmpA基因，高毒力ST11型碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（Carbapenem-Resistant Hypervirulent K. pneumoniae, CR-HvKP)携带rmpA、iuc1和ybt9基因；而牛源菌株中仅少数携带ybt基因，绝大多数缺乏ybt、iuc和iro基因，均未携带rmpA基因。对牛源ST37菌株与人类来源ST37谱系的比较显示，两者核心基因组SNP差异为955–14,313。
**3.3 65株克雷伯菌分离株的抗菌药物敏感性与耐药谱型**
MIC测定结果显示，耐药率最高为氨苄西林（87.69%），其次为头孢呋辛、头孢噻肟和多西环素（各47.69%）。相比之下，环丙沙星、黏菌素、庆大霉素、头孢西丁和替加环素的耐药率较低（4.62%–9.23%）。所有菌株对阿米卡星敏感，仅1株（HN148）对美罗培南耐药。47.69%的菌株对3种及以上抗生素耐药，对6种和7种抗生素耐药的菌株占比最大（分别为16.92%和10.77%）。
**3.4 ESBL产酶克雷伯菌分离株的分子特征**
WGS结果显示，ESBL产酶肺炎克雷伯菌株分属11种ST类型。基于Kleborate分析，31株ESBL产酶菌株被分为13种KL类型。质粒分析揭示blaCTX-M基因主要位于IncFIB(K)（58.1%，18/31）和IncN3（16.1%，5/31）质粒，还与IncQ1、IncHI1等多种质粒类型相关。除ESBL编码基因外，菌株还携带磺胺类耐药基因（sul1、sul2、sul3）、氨基糖苷类耐药基因（aph(3")-Ib和aph(6)-Id）、四环素耐药基因tet(A)和磷霉素耐药基因fosA6等。毒力基因分析显示，除密歇根克雷伯菌和产酸克雷伯菌外，29株肺炎克雷伯菌均携带mrkA、fimH和高毒力因子iutA，7株还检出colibactin基因clpK1。
耐药基因与插入序列（Insertion Sequence, IS)的共现网络分析显示，blaCTX-M-3和blaCTX-M-15主要与ISEcp1相关，而blaTEM-1B、tet(A)和floR与IS6100密切相关。Sankey图分析表明，IncFIB(K)和IncN3质粒常与携带blaCTX-M-3和blaCTX-M-15的肺炎克雷伯菌相关，而IncHI2与blaCTX-M-27相关；ST107和ST716主要与携带blaCTX-M-3和blaCTX-M-15的菌株相关。
**3.5 ESBL产酶菌株的系统发育分析**
基于核心基因组SNP的 phylogenetic tree 显示，所有ESBL产酶菌株聚集于一个主分支内，进一步分为若干亚分支。ST1083分离株（HN84、HN105、HN92和HN85）紧密聚类，SNP差异仅0–4，均来源于同一农场（Z农场，郑州）。ST716分离株（HN89、HN107、HN83、HN117和HN86）也形成紧密簇，SNP差异2–6，来自郑州HM农场。ST107分离株（HN112、HN109、HN119、HN95、HN104和HN90）SNP差异1–7，同样来自郑州HM农场。ST229分离株（HN99、HN101、HN113和HN114）间无SNP差异，尽管其中三株采自安阳H农场、一株来自开封K农场，提示跨地理区域的高度遗传同源性。这些发现表明同一ST内存在克隆传播。
**3.6 blaNDM-1阳性肺炎克雷伯菌株的特征**
肺炎克雷伯菌HN148株含有5,272,525 bp染色体和2个质粒。其中一个质粒pHN148-NDM携带blaNDM-1基因，该质粒长141,407 bp，GC含量51.6%，含409个开放阅读框（Open Reading Frames, ORFs)，属于IncC2型质粒。染色体上携带blaSHV-27、oqxA、oqxB和fosA6等耐药基因；pHN148-NDM质粒则携带6种氨基糖苷类耐药基因、3种叶酸途径拮抗基因、利福平耐药基因arr-3和氯霉素耐药基因catB3。比较基因组分析显示，pHN148-NDM与人源阴沟肠杆菌质粒pCf75（CP047308.1）具有100%序列同一性（99%覆盖度），与虾源副溶血弧菌质粒pVP228-NDM（PP860831.1）也有高度相似性。接合实验证实pHN148-NDM可转移至大肠埃希菌C600，接合频率为4.7×10
-5 。
**四、讨论与结论**
研究人员在讨论部分深入分析了牛源肺炎克雷伯菌的流行病学特征。研究结果显示，65株克雷伯菌分离株表现出高遗传和抗原多样性，KpI系统发育群占主导地位，24种ST的存在提示多克隆感染模式，可能由垫料、水源或饲料等环境储存库驱动。与人类高毒力菌株相比，牛源菌株缺乏rmpA等关键毒力基因，表现出明显的宿主适应性分化：人类高毒力菌株优先获取毒力质粒以实现系统性播散，而牛源菌株似乎更倾向于多重耐药特征，这可能是在农场抗菌药物选择压力下通过水平基因转移形成的适应性策略。
ESBL基因的流行特征尤为突出，47.7%的高检出率与奶牛场第三代头孢菌素的广泛使用密切相关。blaCTX-M-3和blaCTX-M-15的优势流行与全球趋势一致，其播散主要依赖IncFIB(K)和IncN3质粒，以及ISEcp1移动元件的介导。值得注意的是，blaNDM-1阳性IncC2型质粒的检出标志着碳青霉烯耐药菌株已侵入 livestock 环境，该质粒与人和水产来源质粒的高度同源性揭示了跨物种、跨生态位的传播潜力。
**研究结论**方面，研究人员明确指出：该研究揭示了河南省乳腺炎奶牛中牛源克雷伯菌株的高遗传和抗原多样性以及多重耐药特征。菌株群体以KpI系统发育群为主，具有多样化的序列型，提示存在多来源引入，并与人类高毒力肺炎克雷伯菌存在远缘进化关系。尽管关键毒力基因如rmpA缺失，但ESBL产酶菌株流行率高，blaCTX-M基因主要通过IncFIB(K)和IncN3质粒传播。blaNDM-1携带型IncC2质粒的检出凸显了碳青霉烯耐药在 livestock 环境中的出现。这些发现强调了改进抗菌药物管理以及在动物-人-环境界面持续开展监测的紧迫性，以减轻公共和动物健康风险。
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