通过侧基化学工程调控硫缩酮基生物材料的亲水性与氧化降解性能

活性氧（reactive oxygen species, ROS）响应性生物材料在再生医学、药物递送系统及可降解植入物领域受到日益广泛的关注。这类材料具有特殊的应用前景，原因在于愈合组织及炎症过程中局部ROS水平会显著升高。多种含硫缩酮（thioketal, TK）的ROS响应性聚合物已被开发，并因其合成简便及选择性氧化生物降解特性而展现出显著效用。然而，传统TK键相对疏水，且对生理剂量的水溶性ROS响应有限。本研究合成了一系列TK连接子，系统评估了连接子亲水性与ROS介导降解之间的关系。核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）研究表明，亲水性TK构建体在较低ROS浓度下降解更为迅速。采用更亲水性TK交联的水凝胶在暴露于ROS时表现出更显著的聚合物网络降解。当这些TK连接子被整合入支架后，更亲水性变体在氧化条件下质量损失近乎翻倍。该结构-功能关系亦在体内得到验证：将更亲水性TK构建的多孔支架皮下植入大鼠后，其生物吸收显著增强，组织长入得到改善。该研究提出了一种简单而有效的方法，以增强TK材料在再生医学应用中的响应性及功能性。

**研究背景与问题提出**

生物可降解合成聚合物植入物已广泛应用于再生医学领域，尤其作为可侵蚀药物递送系统和可吸收组织工程支架。这类可降解合成材料通常由含酯键聚合物制备，其在生理条件下水解产生无毒低分子量副产物，易于从体内清除。尽管聚酯材料的生物降解速率具有高度可调性，但其预设的降解动力学难以适应异质性患者群体，导致植入物吸收与组织再生速率不匹配，引发严重并发症——过早降解的支架导致伤口愈合不全，或降解过慢的植入物引发纤维化。这些局限性推动了"智能"材料的发展，使其能够动态响应正常及病变组织中不断变化的微环境。

活性氧（ROS）作为促进生物材料特异性响应的生物信号具有特殊优势。ROS是氧的还原形式，包括超氧自由基阴离子（O₂^•−）、过氧化氢（H₂O₂）、次氯酸（HOCl）、羟自由基（•OH）、单线态氧（¹O₂）、过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）及次氯酸根（OCl⁻）等。ROS在健康组织细胞外基质中的H₂O₂浓度约为0.1–1 µM，但在伤口愈合和癌细胞中可高达50 µM。

近二十年来，多种氧化响应性生物材料平台被开发，包括聚硫化物、苯基硼酸酯、聚草酸酯、硫缩醛和硫缩酮等。其中，硫缩酮材料自2010年首次用于炎症靶向纳米颗粒以来，已被用于从纳米级药物递送载体到大规模组织工程构建的多种响应性材料系统。TK材料合成条件温和，且对多种ROS分子敏感，包括H₂O₂、超氧自由基、羟自由基和单线态氧。然而，传统TK键结构中的两个非极性甲基使其相对疏水，限制了其与水溶性ROS的接触，导致在生理ROS剂量下敏感性不足。Martin等开发的ROS触发型TK药物涂层因药物释放过慢而在大鼠颅骨缺损模型中促进骨生长效果不佳；TK基骨水泥在慢愈合大鼠和兔骨缺损模型中也表现出体内降解有限的局限。因此，提高TK材料的氧化敏感性成为该领域的重要突破方向。

**主要技术方法**

本研究的技术路线包含以下关键环节：首先通过酮分子与硫醇单体的酸催化缩合反应合成含不同侧基的TK二聚体库，采用¹H-NMR进行结构表征，并通过高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）测定水/辛醇分配系数（LogP）和分布系数（LogD）以量化亲水性。随后，分别将单硫醇衍生的CTFA-TK连接子和双硫醇DOT-TK连接子暴露于 escalating浓度的H₂O₂中，通过NMR监测TK特征峰的动态变化以评估氧化降解动力学。在材料构建层面，采用4臂聚乙二醇-马来酰亚胺（PEG-MAL，10 kDa，Laysan Bio提供）通过Michael加成反应制备水凝胶；采用三功能环氧交联剂（trimethylolpropane triglycidyl ether）与DOT-TK二硫醇反应制备多孔疏水支架。体内研究采用雄性及雌性Sprague-Dawley大鼠皮下植入模型，通过苏木精-伊红（hematoxylin & eosin, H&E）染色结合组织形态计量学分析支架降解与组织长入情况。此外，研究还构建了以丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate, EP）为模型的TK前药（EPTK），通过HPLC定量药物释放，并以MC3T3-E1细胞评估其生物活性。

**研究结果**

**CTFA-TK连接子库的合成与表征**

研究人员以三氟乙酸保护半胱胺盐酸盐（CTFA）为单硫醇单体，分别与2,2-二甲氧基丙烷（DMP）、乙酰丙酸（LA）和丙酮酸（PA）反应，合成DMPTK、LATK和PATK三种TK二聚体。理论LogP值和实验HPLC测定结果确认LATK和PATK较DMPTK显著更亲水；在pH 7.4条件下，LATK和PATK因羧酸基团去质子化而呈现负LogD值。加速氧化降解研究显示，在1 mM和10 mM H₂O₂条件下，更亲水的LATK和PATK较传统DMPTK降解显著更快；而在50 mM高氧化条件下，所有TK连接子降解速率相似。在更接近生理环境的pH 7.4 PBS + 1 mM H₂O₂条件下，PATK仍保持显著的氧化敏感性，而DMPTK降解减弱，提示甲醇助溶剂可能促进ROS介导的TK断裂。

**DOT-TK连接子库的合成与表征**

研究进一步扩展了TK连接子库，以3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇（DOT）为双硫醇单体，与DMP、LA、PA、草酰乙酸（OGA）、甲磺酰丙酮（MSA）及苄基丙酮（BA）反应，合成涵盖更广亲水性范围的BATK、DMPTK、LATK、OGATK和MSATK连接子。NMR和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）表征确认产物主要为二聚体及少量短寡聚体结构。

**体外水凝胶降解研究**

将DOT-TK二硫醇与PEG-MAL交联制备水凝胶。值得注意的是，OGATK和MSATK在25°C以上可完全溶于水或PBS，而DMPTK不溶于水相介质。在0 mM H₂O₂条件下，所有水凝胶结构稳定；在1 mM、10 mM和50 mM H₂O₂条件下，更亲水的MSATK和OGATK水凝胶较DMPTK水凝胶表现出显著更高的氧化敏感性。在50 mM H₂O₂中，MSATK和OGATK凝胶于第7天完全降解，而DMPTK凝胶至第10天仍保持完整。所有TK凝胶在氧化条件下呈现初始溶胀比增加后平台化的趋势，可能与TK键断裂生成的游离巯基在氧化条件下形成二硫键导致的网络重排有关。

**体外支架降解研究**

将DOT-TK连接子与三功能环氧交联剂反应制备疏水多孔支架。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除实验显示所有TK支架制剂均具有显著的自由基清除能力。在0 mM H₂O₂条件下所有支架稳定；在1 mM、10 mM、50 mM和100 mM H₂O₂条件下，支架降解呈现显著的剂量依赖性和亲水性依赖性。具体而言，在50 mM H₂O₂中，LATK、OGATK和MSATK支架于第30天完全降解，而DMPTK和BATK支架保留超过60%原始质量；在100 mM H₂O₂中，OGATK和MSATK支架于第20天完全分解，LATK于第30天完全分解，而最疏水的BATK降解显著少于DMPTK。值得注意的是，虽然LATK和OGATK因羧酸去质子化在pH 7.4条件下预测比MSATK更亲水，但MSATK在pH 7.4条件下降解更快，提示pH依赖性亲水性不足以完全解释降解动力学差异；同时甲砜基团的吸电子效应理论上应减缓而非加速降解，推测一碳间隔可能缓解了这种电子效应，同时保留了增强的亲水性。

**材料、前体及降解产物的体外细胞毒性评估**

以NIH 3T3成纤维细胞进行细胞毒性评估，包括原始单体、DOT-TK连接子、完全氧化降解产物以及支架洗脱产物四个层次。Cell TiterGlo检测显示所有评估组均呈现极低的细胞毒性。

**体内支架降解研究**

研究人员将含蔗糖致孔剂的多孔DOT-TK支架植入Sprague-Dawley大鼠皮下腹袋，0、2、4周取材行H&E染色及组织形态计量分析。SEM显示所有支架具约50 µm均匀分布孔径，孔隙率约50%。定性观察显示所有植入物均有新生肉芽组织长入，MSATK和OGATK植入物较DMPTK促进更显著的细胞长入。定量分析表明：更亲水的LATK、OGATK和MSATK植入物在4周内较疏水DMPTK和BATK发生显著更多降解；OGATK和MSATK支架在2-4周间呈现活跃的生物吸收性 Scaffold面积显著减少，而BATK、DMPTK和LATK无此趋势。新组织生长与材料亲水性和生物降解动力学直接相关：疏水BATK植入物组织生长最少，最亲水MSATK支架细胞浸润最丰富。特别地，MSATK支架较传统DMPTK配方显示60%增加的生物降解率和翻倍的新组织生长。尽管降解和组织生长存在差异，各组在异物巨细胞（foreign body giant cells, FBGCs）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）表达方面无显著差异，推测可能是由于所有TK制剂相似的抗氧化能力抑制了FBGC形成和肌成纤维细胞活化。

**TK前药的合成与生物活性**

研究人员将具有抗炎活性的天然代谢产物丙酮酸乙酯（EP）整合入TK连接子构建EPTK前药。NMR确认EPTK结构后，氧化降解研究显示其TK键随ROS浓度增加而更快降解，且 surprisingly 在无外源氧化条件下亦呈现低水平降解，为首例兼具氧化和水解双重降解特性的TK结构。HPLC定量显示EP释放量随H₂O₂浓度增加而增加。MC3T3-E1细胞实验中，天然EP几乎完全逆转H₂O₂的细胞毒性；EPTK本身低毒且具一定细胞保护能力；而经ROS预降解完全释放EP的EPTK则近乎完全逆转H₂O₂毒性，证实酮类药物可成功整合入TK聚合物系统并在氧化触发下选择性释放并保持生物活性。

**讨论总结与研究结论**

综合所述，ROS是正常组织功能和疾病过程中的关键分子介导因子。能够特异性利用这些细胞产生分子的生物材料，相较于传统非响应性医疗植入物，作为再生干预手段具有高度优势。在目前可用的ROS响应性平台中，含硫缩酮键的合成聚合物极具前景，因其在水相条件下稳定但在氧化触发下快速降解。然而，传统TK制剂相对疏水，对特定生物医学应用的生理ROS剂量敏感性不足。

本研究通过重新工程化TK键结构，引入更亲水的侧基团以增强这些材料与水溶性ROS的相互作用，从而提高其氧化敏感性。该新型TK连接子家族被整合入水溶胀水凝胶和疏水支架中，证明了TK连接子亲水性增加与生物材料氧化降解增强之间的稳健相关性。这一结构-功能关系在大鼠体内得到验证：更亲水的TK支架皮下植入后降解更快，组织生长优于传统TK配方。此外，该TK平台展示了作为前药治疗的前景，通过将小分子药物复合于TK键内，在氧化触发下成功递送具有生物活性的化合物。

该研究提出了一种简单而强大的方法，用于增强TK材料的响应性和功能性，从而拓宽其在众多再生医学应用中的有效性。研究发表于《Advanced Functional Materials》。