背景(Background)：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是临床机会性致病菌，但携带水平获得毒力决定簇（包括含yopX的染色体基因组岛(genomic island, GI)、假定IV型分泌系统(type IV secretion system, T4SS)及含毒素-抗毒素系统的质粒）的临床菌株对诊疗构成挑战，且其致病遗传基础尚未被全面阐明。方法(Methods)：研究人员对分离自皮肤感染的致病性B. licheniformis菌株LSDY01进行全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)及比较基因组分析，包括系统发育重建、泛基因组(pan-genome)分析及质粒与染色体毒力决定簇详细表征；按标准指南行药敏试验(antimicrobial susceptibility testing, AST)，行生物膜形成实验，并以CCK-8法评估LSDY01对HEK293细胞的细胞毒性。结果(Results)：LSDY01属B. licheniformis序列分型(sequence type, ST)20，与流行ST3仅差一个等位基因，最近缘菌株为酒曲(Daqu)来源CP143961.1和CP143962.1；染色体鉴定出独特水平获得基因组岛(~157 kb，GC 33.03%)及假定T4SS基因簇；新型质粒pLSDY01与环境质粒高度相似，携带yopX、毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系统、pilT及手枪核酶(pistol ribozyme)；LSDY01对亚胺培南和万古霉素敏感，对青霉素、红霉素和氯霉素耐药；CCK-8显示与LSDY01共孵育后HEK293细胞活力降低但无统计学意义(p = 0.0545，CCK-8孵育2 h)。结论(Conclusion)：水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)——包括质粒获得及潜在噬菌体整合——可能促使B. licheniformis演化出具致病性，提示需重新评估传统非致病微生物的安全性。
论文解读：致病性地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株LSDY01的基因组特征与毒力演化机制
本文发表于《Frontiers in Microbiology》。既往地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)多被视为工业用安全菌，但近年其在免疫功能低下宿主中引起菌血症、心内膜炎及软组织感染的机会性致病报道渐增。细菌致病性常由可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)——如质粒、基因组岛(genomic island, GI)及温和噬菌体（前噬菌体prophage）——通过水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)介导获得毒力、生物膜及抗生素抗性基因而实现。然而，临床分离B. licheniformis致病的特异性遗传机制尚不清楚，前噬菌体编码毒力因子是否参与亦未明确。为此，研究人员从临床皮肤感染标本中分离得到B. licheniformis菌株LSDY01，通过全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)结合比较基因组学、表型验证探究其毒力相关遗传架构及致病潜能，旨在揭示该菌种由共生/腐生菌向机会性致病菌演化的遗传基础。
主要关键技术方法：
研究人员对2024年7月中国丽水某三甲医院分离自42岁男性下肢皮肤感染伤口渗液的B. licheniformis菌株LSDY01开展研究。采用Illumina NovaSeq 6000与Nanopore平台联合测序，Unicycler混合组装，Bakta注释，FastANI计算平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)以确证种属，Type Strain Genome Server(TYGS)进行基因组分类，Multi-Locus Sequence Typing(MLST)及core-genome MLST(cgMLST)分析分型与系统发育重建，Roary行泛基因组(pan-genome)分析，BLAST比对Virulence Factors Database(VFDB)及AMRFinderPlus分别预测毒力与耐药基因，OriTFinder预测可移动元件oriT，BRIG(BLAST Ring Image Generator)做圈图比较；以微量肉汤稀释法按CLSI M45指南行药敏试验(antimicrobial susceptibility testing, AST)；结晶紫染色法测生物膜形成能力；CCK-8法检测LSDY01与HEK293细胞共培养24 h后的细胞活力变化，以双尾独立样本t检验分析显著性。
研究结果：
3.1 Genomic features of strain LSDY01（LSDY01菌株基因组特征）
LSDY01染色体长4,363,059 bp（GC 45.63%），含4,490个CDS；质粒pLSDY01长211,930 bp（GC 37.21%），含299个CDS。AMRFinderPlus未检出获得性耐药基因。BLAST比对VFDB确认染色体携带保守毒力基因簇（hlyIII、capA/capB/capD、clpC、tufA、groEL、lplA1、clpE、gnd、clpP、bpsC、lap、bslA/yuaB及铁载体合成操纵子dhbABCDEF等）及T4SS。
3.2 Phylogenetic analysis of strain LSDY01（LSDY01菌株系统发育分析）
TYGS与ANI（与模式株ATCC 14580/DSM 13达99.6%）确认LSDY01归属B. licheniformis种。in silico MLST判定为少见ST20，与全球流行ST3仅单等位基因差异；cgMLST显示其与2016年中国酒曲(Daqu)来源菌株CP143961.1、CP143962.1聚为一支（bootstrap=100）。比较基因组发现LSDY01与CP154901.1共有~157 kb水平获得GI（GC降至33.03%），含yopX、nrdFHI核糖核苷酸还原酶复合体、抗毒素MqsA、DNA修复核酸内切酶RuvC及抗CRISPR基因AcrIIA7；染色体还含罕见T4SS基因簇。质粒pLSDY01与伊朗土壤(CP076292.1)及中国黄粉虫幼虫肠道(CP178437.1)环境质粒高度同源（97.66% identity，99% coverage），携带II型TA系统(yvrJ-yoqJ)、yopX、IV型菌毛回缩ATP酶(pilT)及pistol ribozyme，无耐药基因。
3.3 Compare the pathogenic factors of Bacillus licheniformis（地衣芽孢杆菌毒力因子比较）
VFDB比对识别出14个毒力基因，分四类：黏附定植(hlyIII、capA/capB、capD、bpsC、lap)、应激存活与宿主适应(clpC、clpE、clpP、groEL、tufA)、营养/代谢毒力(dhb操纵子、lplA1)、免疫调节与逃逸(gnd、bslA/yuaB)。其中多数系B. licheniformis种内保守；yoqS、yoqJ及pistol基因为pLSDY01独有，T4SS仅见于LSDY01与个别菌株，hrtA仅存在于少数分离株。
3.4 Biofilm formation capacity of strain LSDY01（LSDY01菌株生物膜形成能力）
结晶紫法检测36 h培养后OD570=0.67±0.05，超4×ODc(0.36)且低于8×ODc，判定为强生物膜产生株(strong biofilm producer)，提示其具较强表面定殖与环境持留潜力。
3.5 Cytotoxic effect of strain LSDY01 on HEK293 cells（LSDY01对HEK293细胞的细胞毒性）
与HEK293细胞共培养24 h后CCK-8检测，细菌组OD450较对照组降低约39%（0.572±0.058 vs 0.940±0.230），2 h读数p=0.0545，其余时间点p>0.05，呈降低趋势但未达统计学显著，提示本实验条件下LSDY01对该细胞系直接细胞毒作用较弱。
讨论与结论总结：
讨论指出LSDY01致病潜能可能源于三方协同：含抗CRISPR基因(AcrIIA7)-yopX的~157 kb GI促进HGT逃避CRISPR-Cas系统清除、染色体罕见T4SS可递送效应蛋白入宿主细胞、质粒pLSDY01通过TA系统(yvrJ-yoqJ)维持稳定并借pilT促表面定殖与天然感受态，加之所证实的强生物膜形成能力可进一步助益基因水平交流。其与酒曲来源菌株的最近缘关系暗示食品发酵环境或为致病变异株基因交换的储存库。研究局限在于主要依赖in silico预测与有限表型验证，毒力效应蛋白功能及体内致病机制待后续实验确证。
结论(Conclusion)：研究人员发现B. licheniformis LSDY01具备由质粒稳定系统、含抗CRISPR核心的水平获得基因组岛、染色体散在毒力决定簇及强生物膜形成能力构成的毒力相关遗传工具包，HGT（含质粒获得及潜在噬菌体整合）可能驱动其演化至致病菌株，强调应依据积累的基因与临床证据持续重新评估传统视为非致病或低风险的微生物之安全性。
