摘要：双核乳腺上皮细胞（binucleated mammary epithelial cells, MEC）在小鼠（mice）中促进乳汁分泌，但其在包括奶牛（dairy cattle）在内的物种中的普遍性和功能尚不清楚。本研究旨在确定泌乳期牛乳腺中双核MEC的发生率及其贡献。在第一项研究中，研究人员对未产荷斯坦母牛（nulliparous Holstein heifers）诱导泌乳，同时通过乳腺内注射核苷类似物（EdU和BrdU）标记分裂中的MEC，并/或联合递送极光激酶抑制剂（aurora kinase inhibitor, alisertib）以阻断双核形成。在第二项研究中，研究人员测定了多胎荷斯坦母牛（multiparous Holstein cows）乳腺中双核MEC的丰度，这些母牛因单侧高频挤奶（unilateral frequent milking）而单侧产奶量增加。与小鼠数据相反，牛乳腺中双核MEC仅占总MEC群体的1%–3%。有趣的是，乳腺后区（rear quarters）的双核MEC比例（1.1%）高于前区（front quarters，0.7%）。在乳腺发育期（mammogenesis）乳腺内注射alisertib倾向于降低产奶量，并与泌乳开始时乳汁中体细胞（somatic cells）和MEC丰度升高相关。在激素诱导泌乳过程中，细胞增殖（cellular proliferation）在生长期和泌乳期均持续较低，EdU或BrdU标记的MEC在标记后长达39天（d）仍保留于泌乳乳腺中。响应于增加挤奶频率，双核MEC的发生率倾向于从2%增至3.2%（上皮细胞比例），而Ki-67阳性MEC的发生率从1%降至0.5%。综合来看，这些数据表明双核MEC在牛乳腺中构成一个小但具有潜在意义的细胞群体。
论文解读文章
研究背景与问题：奶牛的产奶能力主要由乳腺上皮细胞（mammary epithelial cells, MEC）的数量和活性决定，这些细胞在妊娠期和泌乳期经历激素诱导的增殖。然而，关于牛乳腺中MEC的时空动态变化，尤其是其在妊娠-泌乳过渡期的命运，仍存在认知空白。传统假设认为所有MEC含有等量DNA，但近年在小鼠中发现双核MEC（binucleated MEC）通过极光激酶A（AURKA）过表达导致胞质分裂失败而形成，且占MEC的较高比例（约50%），对泌乳至关重要。在奶牛中，双核MEC的普遍性和功能尚不明确。此外，高频挤奶可提高产奶量，但其是否通过影响双核MEC形成发挥作用也未可知。因此，研究人员旨在系统阐明牛乳腺中双核MEC的发生率、分布及其与产奶量的关联。
研究内容与结论：本研究采用两个实验模型：激素诱导泌乳模型（模拟生长分化变化）和单侧高频挤奶（UFM）模型。通过乳腺内注射核苷类似物（EdU和BrdU）标记增殖MEC，并结合AURKA抑制剂alisertib阻断双核形成，利用共聚焦显微镜分析MEC的核型。结果表明，牛乳腺中双核MEC仅占总MEC的1%–3%，远低于小鼠。后区双核MEC比例（1.1%）显著高于前区（0.7%）。在激素诱导泌乳过程中，MEC增殖率持续较低（EdU标记率约0.7%–0.9%），且标记后的MEC可保留至泌乳第32天。经alisertib处理的乳腺区产奶量有下降趋势（P=0.074），泌乳第一天乳汁中体细胞和MEC数量增加，但对双核比例无显著影响。在UFM实验中，4倍挤奶区双核MEC比例从2.0%增至3.2%（P=0.084），而Ki-67阳性MEC比例从0.9%降至0.5%（P=0.049），两者呈负相关（P=0.048）。该研究论文发表于《Journal of Dairy Science》。
关键技术方法：
1. 激素诱导泌乳模型：对未产荷斯坦母牛（n=8）注射17β-雌二醇和孕酮（0.1 mg/kg和0.25 mg/kg BW）9天，随后用地塞米松启动泌乳，自第21天起每日挤奶。
2. 核苷类似物标记法：在激素处理第14天和第19天对特定乳区乳腺内注射EdU（40 mM）和/或AURKA抑制剂alisertib（290 μM）；在泌乳第2天静脉注射BrdU（5 mg/kg BW）标记分裂MEC。
3. 共聚焦显微镜与免疫组化：30 μm厚石蜡切片，使用抗E-钙黏蛋白（E-cadherin）和麦胚凝集素（WGA）标记细胞膜，通过点击化学反应检测EdU，免疫荧光检测BrdU和Ki-67，经去卷积和三维重建手动鉴定双核MEC。
4. 单侧高频挤奶（UFM）模型：多胎荷斯坦母牛（n=12）从泌乳第3至23天，左侧挤奶2次/天，右侧4次/天，泌乳第23天手术切取双侧后乳区组织进行分析。
研究结果：
Study 1: Cellular dynamics for heifers induced to lactate
所有母牛成功泌乳，日产奶量从2.5 kg增至11.2 kg。Alisertib处理区产奶量有下降趋势（P=0.074），但乳汁成分（脂肪、蛋白、乳糖、总固形物、酪蛋白）无差异。泌乳第一天，alisertib处理区乳汁体细胞数显著高于对照（P=0.002），且后区alisertib处理区MEC比例（10.24%）高于前区（2.13%）（P=0.036）。双核MEC比例在后区（1.1%）显著高于前区（0.7%）（P=0.005），alisertib无影响。EdU标记率在泌乳期仅0.7%–0.9%，BrdU标记率为0.6%–0.7%，两者均不受alisertib影响。极少数MEC（<0.01%）同时被EdU和BrdU双标记。
Study 2: Cellular dynamics in UFM cows
4倍挤奶区产奶量增加25%（Hanling, 2022）。双核MEC比例从2.0%升至3.2%（P=0.084），Ki-67阳性MEC比例从0.9%降至0.5%（P=0.049）。两者呈显著负相关（P=0.048）。
讨论与结论：
讨论指出，与小鼠不同，牛乳腺中双核MEC仅占小部分（1%–3%），这可能反映物种间MEC增殖动力学和泌乳持续性的差异。后区双核MEC比例高于前区，与后区产奶量较高一致。UFM导致双核MEC增加而Ki-67降低，提示高频挤奶促使MEC转向终末分化的双核状态，而非继续分裂，可能解释早期泌乳“机会窗口”中的持续产奶增益。Alisertib未能阻断双核形成，可能与剂量、给药时机或双核形成时间窗口不匹配有关。
结论部分翻译：双核MEC在奶牛乳腺中仅占总MEC群体的小部分，与小鼠不同。后区双核MEC比例高于前区，以及响应高频挤奶而增加，可能解释这些情境下的产奶量差异。此外，研究表明存在持续存留于泌乳期的不同MEC群体，深化了对MEC动力学和长寿的理解。未来方向包括确定牛乳腺中MEC双核化的精确时间线和机制，这可能为优化奶牛产奶量提供策略。
