自噬蛋白GABARAP的最低限度N-甲基化和订书肽抑制剂

自噬蛋白GABARAP的最低限度N-甲基化和订书肽抑制剂

LC3/GABARAP蛋白家族是选择性抑制自噬（autophagy）的有前景的靶点。此外，LC3/GABARAP配体已被用作可溶性蛋白、蛋白聚集体、线粒体、脂滴和RNA的靶向降解子（targeted degraders）。然而，用于此类应用的小分子存在结合亲和力差和已知脱靶效应的问题。由于LC3/GABARAP蛋白具有长而浅的结合凹槽，因此是小分子药物开发的挑战性靶点。在这项工作中，研究人员评估了多种稳定天然结合基序（binding motif）延伸结构的方法，生产出具有低纳摩尔亲和力的N-甲基化肽和订书肽（stapled peptides）。晶体结构和分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟支持一个模型，即N-甲基化将该基序预先组织成延伸的、类链（strand-like）结构。N-甲基化使得结合基序可最小化为四肽，同时保持亚微摩尔亲和力，并最小化电荷和总分子量。截短的、N-甲基化的四肽在人工膜和基于细胞的transwell实验中显示出被动渗透性。这些结果突出了LC3/GABARAP配体的新类药空间（drug-like space），具有高亲和力和亚家族选择性。

**研究背景与问题**

巨自噬（macroautophagy，以下简称自噬）是真核细胞中一种必需的降解回收途径，胞质物质通过该途径被运送至溶酶体进行降解。在基础水平上，自噬作为质量控制机制降解错误折叠蛋白、受损细胞器和病原体；在饥饿、营养缺乏、缺氧或氧化应激等压力条件下，自噬被上调以维持蛋白质稳态（proteostasis）并提供代谢物。Atg8蛋白家族对所有真核生物的自噬至关重要。人类Atg8蛋白包括LC3蛋白（LC3A、LC3B、LC3C）和GABARAP蛋白（GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2/GATE16）。LC3/GABARAP蛋白可逆地结合膜脂质，作为蛋白质-蛋白质相互作用模块介导自噬体的起始、延伸、闭合、运输以及与溶酶体的融合，同时对招募货物至自噬体进行降解也至关重要。因此，LC3/GABARAP配体既被寻求作为特异性自噬抑制剂，也被用作靶向蛋白降解子的组成部分，将目标蛋白连接至自噬体。

LC3/GABARAP蛋白的天然蛋白质-蛋白质相互作用几乎普遍通过一种称为LC3相互作用区域（LC3-interacting region, LIR）的短肽基序介导，其共有序列为[W/F/Y]-X1-X2-[V/I/L]。在该结合基序中，特定的人LC3/GABARAP旁系同源物（paralogs）在芳香族位置、脂肪族位置和/或间隔氨基酸处有特定的残基偏好。LIR基序以延伸的、β-链样构象结合，与LC3/GABARAP形成短分子间β-折叠。此前研究利用肽订书（peptide stapling）或计算设计产生了对LC3B、GABARAP或两者具有高亲和力的肽，但这些研究均使用较大的肽支架，可能导致细胞穿透性差。例如，Kritzer团队此前生产的12-mer订书肽具有中低纳摩尔亲和力，但仍需微摩尔浓度才能对自噬产生效应。目前最有效结合人LC3/GABARAP蛋白的小分子具有微摩尔亲和力，且大多数已知会结合其他非自噬相关的人蛋白。

鉴于上述问题，本研究旨在利用构象稳定化开发更小的肽类或肽模拟物（peptidomimetic）配体用于GABARAP，同时保持亚微摩尔亲和力。构象稳定化最常见于α-螺旋的分子内交联或"订书"，类似策略已扩展至β-发夹和β-折叠等其他结构。最近，通过分子内(i,i+2)侧链订书稳定延伸结构的策略已被探索。受此前工作的启发，研究人员旨在将(i,i+2)订书和N-甲基化应用于LIR肽，以开发尺寸更小的高亲和力结合物，目标是产生被动细胞可穿透的化合物。

**主要技术方法**

研究人员以源自Unc-51样蛋白激酶（ULK1）的LIR肽为起点，通过荧光偏振（fluorescence polarization）结合实验测定亲和力；设计并合成订书肽时采用二甲基苯（dimethylbenzene, dmb）连接子进行侧链交联；通过N-甲基化修饰肽骨架；采用X射线晶体学解析肽-GABARAP复合物结构；运用偏差交换元动力学（bias-exchange metadynamics）进行全原子显式溶剂分子动力学模拟，分析骨架二面角分布；使用平行人工膜渗透性实验（parallel artificial membrane permeability assay, PAMPA）和Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞单层渗透性实验评估被动渗透性；最终以AlphaScreen竞争性结合实验检测抑制效力。

**研究结果**

ULK1九聚体肽起始点：研究人员选择源自ULK1的LIR肽作为起点，该肽对GABARAP具有相对较高亲和力（20-mer肽的Kd = 50 nM），且对GABARAP而非LC3B具有选择性。将20-mer ULK1肽截短为9个残基（TDDFVMVPA，含经典LIR基序FVMV），并以正亮氨酸（norleucine）替代甲硫氨酸避免氧化，N端标记荧光素。所得肽M1对重组GABARAP的Kd为557 nM，作为测试订书肽和N-甲基化策略的良好起点。

M1的订书类似物：基于ULK1-GABARAP晶体结构，研究人员在M1的(i,i+2)和(i,i+3)位置设计订书肽，采用二甲基苯连接子促进延伸结构。结果发现，(i,i+3)订书（M3）和meta-dmb的(i,i+2)订书（M7）均降低亲和力；而para-dmb的(i,i+2)订书（M8）使亲和力提高2倍（Kd = 218 nM）。值得注意的是，在核心LIR基序位置（Val5和Val7）引入订书时，para-dmb订书比meta-dmb订书更兼容GABARAP结合。青霉胺（penicillamine）替代实验表明，订书肽M8可能与亲本ULK1肽采取不同结合构象。

M1的N-甲基化类似物：在核心LIR基序骨架评估N-甲基化的影响。Val5和Val7位置的N-甲基化几乎完全破坏结合，因这些位置的酰胺质子与GABARAP形成氢键；Phe4的N-甲基化也显著降低亲和力；而Nle6的N-甲基化使结合亲和力提高5倍（M11的Kd = 107 nM）。研究人员推测这种亲和力增加源于未结合肽构象系综的改变。

Trp替代增强亲和力：将Phe4替换为Trp后，M1及其订书和N-甲基化类似物的亲和力均提高约10倍。M13（仅Trp替代）Kd = 43 nM；M14（订书+Trp）Kd = 15 nM；M15（N-甲基化+Trp）Kd = 9.6 nM。

订书与N-甲基化的不兼容性：将两种修饰结合（M17）产生的亲和力（Kd = 71 nM）低于单独修饰，表明两者效应非加和性。分子动力学模拟揭示，订书和N-甲基化各自促进延伸结构，但N-甲基化norleucine的二面角偏好与订书肽显著不同：订书使norleucine偏向更大负值ϕ的延伸结构，而N-甲基化使其偏向正值ϕ区域；两者结合时norleucine偏好介于β/PPII和α-螺旋之间的区域。这些结果表明N-甲基化和订书将骨架预先组织成不同的构象系综。

M15与GABARAP的晶体结构：解析了M15与GABARAP复合物的1.42 Å分辨率晶体结构，显示M15以几乎与亲本ULK1肽相同的模式结合，核心LIR基序骨架重原子均方根偏差（RMSD）仅为0.1 Å。N-甲基指向溶剂，Trp4位于预期的疏水口袋中。

订书和N-甲基化肽的截短：为朝向更易渗透的化学空间，研究人员对肽进行截短。订书肽M14的N端截短导致约14倍亲和力损失（M18），C端截短也有类似损失（M19），同时截短产生核心序列WCJC的订书四肽M20，亲和力更差（>1.6 µM）。N-甲基化肽M15的截短显示不同模式：N端截短损失13倍亲和力（M21），但C端截短仅损失2倍（M22），同时截短产生N-甲基化四肽M23，Kd = 162 nM，仍保持亚微摩尔亲和力且无带电荷残基。进一步去除N端酰胺（以3-吲哚乙酸替代Trp，M24）使AlphaScreen的IC50从3.67 µM降至16.7 µM，表明存在结合亲和力与进一步截短之间的权衡。

GABARAP对LC3B的选择性：大多数测试肽在高达2 µM蛋白浓度下对重组LC3B无结合或结合极弱，表明所有修饰后的ULK1衍生肽保持对GABARAP超过200倍的选择性。

被动渗透性：9-mer肽M13、M14和M15在PAMPA中显示可忽略的被动渗透性，在MDCK中有中等渗透性（可能由于主动转运）。而四肽M23和三肽类似物M24在PAMPA中显示中等膜渗透性，在MDCK中增强渗透性。M24在MDCK中渗透性低于M23，但在PAMPA中更高。数据表明截短产生了具有亚微摩尔抑制效力和中等被动渗透性的N-甲基化LIR肽。

**讨论与结论**

研究人员在讨论中指出，肽的构象稳定化长期以来被用于产生有效的肽模拟物以阻断蛋白质-蛋白质相互作用，而本研究将这一努力扩展至LIR基序，利用订书和骨架N-甲基化策略产生了GABARAP的纳摩尔结合物。N-甲基化不改变结合结构，但将结合亲和力提高5倍。虽然N-甲基化是常见的肽修饰，但此前工作多涉及环肽、螺旋肽、转角区域或异手性骨架的N-甲基化。Wilson团队的工作提供了关于N-甲基化对β-链预组织和结合热力学效应的最全面分析，表明线性N-甲基化肽的未结合状态具有较低的构象熵，从而导致结合动力学（结合速率）和热力学（结合自由能）的改善。本研究的实验结果和未结合态的分子动力学模拟广泛支持N-甲基化类似降低未结合LIR肽构象熵、从而改善结合自由能的模型。

研究人员对N-甲基化与侧链订书缺乏协同效应感到惊讶。分子动力学模拟在准确模拟N-甲基化残基方面存在局限，表现为对正值ϕ的偏差，这可能由于力场未能准确参数化N-甲基化改变的骨架扭转角和肽键顺/反异构化。即便如此，模拟确实表明N-甲基化肽和订书肽在未结合时占据不同构象系综：N-甲基化肽的大多数系综中未维持与(i,i+2)订书兼容的间距。此外，N-甲基化肽的结合晶体结构与meta-dmb订书并非完全兼容，需要骨架构象和侧链扭转角的改变。对于订书肽，para-dmb比meta-dmb更受青睐的观察，可能源于订书与GABARAP的相互作用，或norleucine处轻微扭曲的β-链构象。多个独立的证据支持订书肽以不同于经典β-链LIR基序的构象结合GABARAP。

本研究将ULK1肽最小化为具有低分子量、无电荷残基和仅三个骨架氢键供体的被动渗透性、GABARAP特异性配体。化合物M23的被动渗透性测量约为1.15 × 10⁻⁶ cm s⁻¹，与已知细胞活性的中等渗透性天然产物相当。仍有进一步改善结合亲和力和被动渗透性的空间：结晶结构显示甲硫氨酸侧链采取两种构象，该位置更大的侧链可能改善亲和力；吲哚的进一步功能化也可能提高亲和力；成功将配体最小化为四肽将促进使用溶液相合成进行进一步开发，包括内部酰胺键的酰胺键等排体替换以及末端更多样化官能团的附加。

在多项靶向蛋白降解最新研究中，将目标蛋白连接至GABARAP特别有效地促进了自噬降解。GABARAP的小分子配体作为自噬调节剂和靶向降解子组分持续受到高度关注。然而，由于其浅凹槽，这是特别具有挑战性的蛋白质-蛋白质相互作用，现有小分子化合物通常具有微摩尔亲和力和已知脱靶相互作用。研究人员预期肽模拟物GABARAP配体的持续开发将提供比现有化合物更高亲和力、更好细胞穿透性和更少脱靶效应的化合物。对GABARAP具有高选择性的肽和化合物（如M15和M23）将特别有助于理解GABARAP在自噬和自噬介导的靶向蛋白降解中区别于LC3B和其他旁系同源物的作用。M23代表了药物化学的令人兴奋起点，用于生产对此挑战性蛋白质-蛋白质相互作用具有亚微摩尔亲和力的类药化合物。虽然细胞中自噬效应尚未观察到，但此类实验正在与持续优化并行进行。完全优化的类药化合物将非常适合在疾病模型中探索自噬调节和靶向蛋白降解。