订书钉寡核苷酸诱导稳定RNA G-四链体结构用于蛋白质翻译抑制的基因治疗新策略

本研究报道了一种名为RNA hacking（RNAh）的新技术，通过设计订书钉寡核苷酸（Staple oligomer）特异性结合靶标mRNA并诱导形成RNA G-四链体（rG4）结构，有效抑制蛋白质翻译。该技术成功调控了TPM3、MYD88和TRPC6基因表达，在主动脉缩窄小鼠模型中有效预防心肌肥大，且无需依赖生物酶促反应，为核酸药物开发提供了新思路。

在基因治疗领域，RNA干扰（RNAi）和反义寡核苷酸技术曾带来革命性突破，但其临床应用仍面临体内稳定性差、靶向特异性不足等挑战。传统核酸药物需要与细胞内酶类（如Argonaute或RNase H）协同作用，而化学修饰虽能提高稳定性，却往往削弱基因沉默效能。是否存在一种既能保持高效性，又具备高度靶向性的新方法？日本熊本大学等机构的研究团队在《Nature Biomedical Engineering》发表的研究，提出了一种名为"RNA hacking"（RNAh）的创新技术。

该研究的核心技术在于设计一种特殊的"订书钉寡核苷酸"（Staple oligomer），它能同时识别mRNA上两个相距较远的G-富集区（G-tracts），通过分子内杂交将分散的G-富集区拉近，人工诱导形成稳定的RNA G-四链体（rG4）结构。这种结构能有效阻碍核糖体扫描，从而抑制蛋白质翻译过程。与传统方法不同，RNAh技术不依赖细胞内酶促反应，允许使用全非天然核酸构建订书钉寡核苷酸，大大提高了体内稳定性。

研究团队采用多种实验方法验证技术可行性：通过硫黄素T（ThT）和N-甲基卟啉IX（NMM）荧光探针检测rG4形成；利用圆二色谱（CD）分析rG4拓扑结构；通过逆转录酶终止实验（RTase stop assay）验证rG4对逆转录的抑制；采用双荧光素酶报告系统评估翻译抑制效率；并在细胞和小鼠模型中检验技术效果。

研究结果部分显示，团队首先在体外验证了RNAh技术的可行性。设计包含63、100和140核苷酸环状结构的rG4模型序列，40核苷酸的DNA订书钉寡核苷酸能有效诱导rG4形成，荧光强度和热稳定性分析证实了结构的稳定性。值得注意的是，26核苷酸的短链寡核苷酸无法有效诱导rG4，表明链长对功能至关重要。

在TRPC6基因应用方面，研究团队成功设计针对TRPC6 mRNA 5'非翻译区（5'UTR）的订书钉寡核苷酸。荧光实验显示，26核苷酸和40核苷酸的RNA订书钉寡核苷酸均能诱导TRPC6 mRNA形成rG4结构。细胞实验表明，订书钉寡核苷酸能有效抑制TRPC6蛋白表达，效果与已知siRNA相当。

小鼠体内实验结果显示，通过腺相关病毒6型（AAV6）递送订书钉寡核苷酸，能在心脏和肝脏中特异性抑制TRPC6表达，而肾脏中无显著变化。重要的是，qPCR检测发现TRPC6 mRNA水平未发生改变，证实RNAh技术通过翻译抑制而非mRNA降解发挥作用。在主动脉缩窄（TAC）诱导的心肌肥大模型中，订书钉寡核苷酸处理能显著减轻心肌重量增加，维持心脏功能，减少心肌纤维化。

技术优化方面，研究团队展示了使用非天然核酸——无环L-苏糖醇核酸（L-aTNA）构建订书钉寡核苷酸的可行性。L-aTNA订书钉寡核苷酸在心脏中能稳定存在达6周，而普通RNA寡核苷酸1周内即降解。单次注射L-aTNA订书钉寡核苷酸能持续抑制TRPC6表达达5周，有效维持TAC模型小鼠的心脏功能。

讨论部分强调，RNAh技术通过靶向特异性杂交和高阶结构诱导的双重机制，实现了精确的基因调控。生物信息学分析显示，约65%的人类mRNA含有潜在的rG4形成序列，表明该技术具有广泛的应用前景。与RNAi技术相比，RNAh不依赖细胞内酶系统，允许更灵活的非天然核酸修饰，为开发更安全、高效的核酸药物提供了新途径。

该研究的创新性在于提出了一种全新的基因表达调控机制，克服了传统核酸药物的局限性。特别是其高度靶向性能有效区分同源基因，如TRPC6与TRPC3，解决了计算化学方法难以避免的脱靶效应问题。未来结合先进的药物递送系统，RNAh技术有望成为基因治疗领域的重要补充，为罕见病和精准医疗提供新策略。