阿片受体κ型OPRK1通过SLC9A3R1/自噬/REST轴驱动去势抵抗性前列腺癌神经内分泌分化的机制与靶向治疗研究

本研究针对第二代雄激素受体（AR）通路抑制剂（ARPI）如恩杂鲁胺（ENZA）诱导的神经内分泌前列腺癌（t-NEPC）这一临床难题，揭示了OPRK1作为AR负调控的关键驱动因子，通过结合SLC9A3R1激活自噬通路、降解REST蛋白，进而促进前列腺癌细胞神经内分泌分化（NED）、上皮间质转化（EMT）及谱系可塑性。该研究不仅阐明了t-NEPC发生的新机制，还发现OPRK1拮抗剂JTC-801联合自噬抑制剂氯喹（CQ）能有效抑制NEPC进展，为t-NEPC的治疗提供了新的靶点和策略，具有重要的理论意义和临床转化价值。

在男性癌症相关死亡中，前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）占据重要地位。虽然第二代雄激素受体（Androgen Receptor, AR）通路抑制剂（AR Pathway Inhibitors, ARPIs），如恩杂鲁胺（Enzalutamide, ENZA），显著延长了转移性去势抵抗性前列腺癌（Castration-Resistant Prostate Cancer, CRPC）患者的生存期，但长期应用这些强效ARPI却催生了一个极具侵袭性的亚型——治疗诱导的神经内分泌前列腺癌（Treatment-induced Neuroendocrine Prostate Cancer, t-NEPC）。t-NEPC患者预后极差，中位生存期不足一年，其分子机制尚未完全阐明，是目前前列腺癌治疗面临的主要挑战。肿瘤细胞通过谱系可塑性（Lineage Plasticity）从AR依赖的腺癌表型转变为AR不依赖、具有神经内分泌（Neuroendocrine, NE）特征的t-NEPC，是产生治疗抵抗的关键途径之一。因此，深入探索t-NEPC发生发展的驱动因素和分子通路，对于开发有效治疗策略至关重要。

本研究综合利用生物信息学分析、转录组测序（RNA-seq）、体外细胞模型、体内动物实验以及蛋白质组学等多种技术方法。研究分析了包括Beltran 2016、GSE66187在内的多个临床前列腺癌队列数据集。通过长期ENZA暴露建立了t-NEPC细胞模型。实验技术涵盖染色质免疫共沉淀（ChIP）、荧光素酶报告基因、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、分子对接、免疫印迹、免疫荧光、细胞功能实验（CCK-8, EdU, 克隆形成, 肿瘤球形成）以及裸鼠异种移植模型等。患者CRPC和组织样本来源经南京医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准。

OPRK1在t-NEPC中表达上调

研究人员通过长期ENZA处理AR阳性的LNCaP细胞，成功构建了模拟临床t-NEPC的细胞模型（t-NEPC细胞）。RNA-seq分析发现，与亲本LNCaP细胞相比，κ型阿片受体（OPRK1）在t-NEPC细胞中显著上调。临床数据分析进一步证实，OPRK1的mRNA和蛋白水平在NEPC患者组织中均高于CRPC-腺癌（CRPC-AD）和原发性前列腺癌，且其高表达与NE标志物（如NSE）正相关，并与不良临床特征（高Gleason评分、晚期T分期、转移、短生存期）相关。这些结果表明OPRK1与t-NEPC的发生发展密切相关。

AR信号负向调控OPRK1的表达

机制探索发现，AR信号通路与OPRK1表达呈负相关。雄激素（R1881）刺激可抑制OPRK1表达，而ARPI（ENZA）处理或AR基因敲低则会上调OPRK1。生物信息学预测和实验验证（ChIP-qPCR、荧光素酶报告基因）表明，AR能够直接结合到OPRK1启动子区的三个雄激素反应元件（AREs）上，并招募组蛋白甲基转移酶（如EHMT2/EED）介导抑制性组蛋白修饰H3K27me3的沉积，从而直接转录抑制OPRK1的表达。因此，ARPI治疗通过解除AR对OPRK1的转录抑制，导致OPRK1表达上调。

OPRK1是维持NEPC细胞NE特征和恶性表型所必需的

功能实验表明，在t-NEPC或PC3细胞中敲低OPRK1，会导致NE标志物（NSE, SYP）表达下降，细胞神经样形态（神经突数量和长度）减少，增殖、克隆形成和肿瘤球形成能力显著受损，在裸鼠体内的成瘤能力也减弱。有趣的是，OPRK1敲低还能促使t-NEPC细胞向AR阳性的管腔谱系逆转，表现为AR及其靶基因（PSA, NKX3.1, TMPRSS2）表达恢复。相反，在AR阳性细胞（LNCaP, VCaP）中过表达OPRK1，则能抑制AR信号，诱导NE标志物表达，并增强细胞的增殖、干细胞特性及在去势小鼠体内的肿瘤生长能力。这些结果证明OPRK1是驱动并维持前列腺癌细胞NE表型和恶性进展的关键因子。

OPRK1-SLC9A3R1信号通过自噬介导的REST降解驱动NEPC可塑性

为了解析OPRK1的下游机制，研究人员通过定量蛋白质组学发现SLC9A3R1是OPRK1的首要相互作用蛋白。Co-IP、免疫荧光和GST pull-down实验证实了OPRK1与SLC9A3R1之间存在直接物理相互作用。分子对接和截短/点突变分析进一步确定，SLC9A3R1的PDZ I结构域（特别是K19残基）是结合OPRK1所必需的。

研究发现，OPRK1通过结合SLC9A3R1激活了自噬通路。重要的是，OPRK1过表达或激活并不影响神经元限制性沉默因子（REST）的mRNA水平，但通过自噬途径显著降低了REST的蛋白稳定性。自噬抑制剂氯喹（CQ）处理可以逆转OPRK1引起的REST降解。而REST作为抑制神经元分化程序的关键转录抑制因子，其蛋白水平的下调是NEPC的一个分子标志。因此，OPRK1-SLC9A3R1-自噬轴通过降解REST蛋白，解除了对NE基因程序的抑制，从而驱动了神经内分泌分化和谱系可塑性。

JTC-801联合CQ通过抑制OPRK1/自噬轴抑制NEPC进展

基于上述机制，研究评估了OPRK1拮抗剂JTC-801的治疗潜力。分子对接显示JTC-801与OPRK1具有高亲和力。体外实验表明，JTC-801能以剂量依赖方式抑制t-NEPC和PC3细胞的增殖，降低OPRK1、SLC9A3R1蛋白水平，抑制自活和EMT，并恢复REST蛋白表达。OPRK1过表达可削弱JTC-801的抑制作用。更重要的是，在PC3细胞异种移植瘤模型中，JTC-801与自噬抑制剂CQ联用，相比单药能更有效地抑制肿瘤生长，并逆转NEPC相关的分子特征。这为靶向OPRK1通路治疗t-NEPC提供了临床前依据。

本研究揭示了一个驱动t-NEPC发展的新颖分子轴：ARPI治疗解除AR对OPRK1的转录抑制，导致OPRK1上调；高表达的OPRK1通过其PDZ I结构域直接结合SLC9A3R1，进而激活自噬通路；活化的自噬促进关键转录抑制因子REST的蛋白降解，从而解除其对神经元/神经内分泌基因程序的抑制，最终驱动前列腺癌细胞发生神经内分泌分化和谱系可塑性，导致t-NEPC的产生和ARPI耐药。

该研究不仅深入阐述了t-NEPC的发病机制，揭示了OPRK1在这一过程中的核心驱动作用及其与AR信号之间的相互拮抗关系，更重要的是，提出了靶向OPRK1（如使用JTC-801）并结合自噬抑制（如使用CQ）作为治疗t-NEPC的潜在联合治疗策略。这为克服前列腺癌治疗中面临的严峻挑战——治疗诱导的谱系转换和耐药，提供了新的理论依据和有前景的治疗方向，对改善晚期前列腺癌患者的预后具有重要意义。相关研究成果发表在《Cell Death & Disease》上。