基于化学诱导全能样细胞的连续胚胎模型重现小鼠从合子基因组激活到原肠胚形成的完整胚胎发育过程

本研究开发了一种化学鸡尾酒法诱导具有持续增殖能力的全能样细胞，并逐步构建了模拟小鼠从合子基因组激活（ZGA）到原肠胚形成的胚胎模型。该模型成功重现了从2细胞期、囊胚形成到植入后发育的关键里程碑，为哺乳动物胚胎发生的体外研究提供了全新平台。

化学鸡尾酒法诱导具有增殖优势的全能样细胞

研究团队通过小分子化合物筛选，鉴定出由CD1530（视黄酸激动剂）、CHIR-99021（WNT信号激动剂）、PD0325901（MEK抑制剂）和elvitegravir（HIV整合酶抑制剂）组成的化学鸡尾酒配方。该组合能有效诱导小鼠扩展多能干细胞（EPS细胞）转化为表达ZSCAN4和MuERV-L-Gag等全能性标志物的细胞簇，其倍增时间仅12.75小时，接近早期小鼠胚胎的卵裂动力学（11-18小时）。单细胞转录组分析显示诱导细胞包含三个亚群：S1-1（17.3%）呈现吞噬作用和胎盘发育相关基因特征；S1-2（60.9%）具有早期2细胞胚胎转录特征；S1-3（21.8%）富集中晚期2细胞胚胎标志基因。伪时间轨迹分析证实细胞从S1-1向S1-3逐步过渡，模拟了从囊胚向全能卵裂球的发育进程。

重现4细胞至64细胞阶段的胚胎谱系分化

通过添加birabresib（BET抑制剂）和8-Br-cAMP（cAMP类似物），S1细胞簇可进一步分化为表达NR5A2和TFAP2C的4细胞样结构。这些双潜能激活因子促进胚胎与胚外谱系分化，形成表达4细胞、8细胞和16细胞阶段标志基因的细胞聚合体。单细胞转录组整合分析显示，S2细胞与4-16细胞期卵裂球聚类，而S3细胞则呈现32-64细胞期胚胎的转录特征。值得注意的是，S1-3亚群（高表达Zscan4）与后续发育轨迹分离，表明仅Zscan4阴性细胞能进入后续发育阶段。

全能样细胞来源的囊胚样结构形成

采用CHIR-99021、GA-017（YAP激动剂）、bFGF和BMP-4组合处理，75.9%的64细胞样聚合体可在3天内形成囊胚样结构（blastoids）。这些结构表达OCT4⁺（上胚层）、CDX2⁺（滋养层）和SOX17⁺（原始内胚层）细胞，直径与细胞总数与E4.5天然囊胚相当。但囊胚样结构显示上胚层比例偏高而原始内胚层偏低，与既往研究一致。单细胞转录组分析确认存在EPI、TE和PrE三种谱系细胞，且与天然囊胚对应细胞类型高度相似。机制研究表明，抑制RHO-ROCK信号或视黄酸信号会显著降低囊胚形成效率，与天然胚胎发育规律一致。

早期囊胚样结构向植入后胚胎样结构发育

将早期囊胚样结构用含FGF-4、Activin A、BMP-4和XAV939（WNT抑制剂）的培养基处理，50.2%形成E5.5样胚胎结构，呈现卵圆柱状形态并被 visceral endoderm（VE）样细胞层包裹。免疫荧光显示OCT4⁺与CDX2⁺细胞形成独立玫瑰花结结构，单细胞测序鉴定出上胚层（EPI）、胚外外胚层（ExE）和 visceral endoderm（VE）谱系。特别值得注意的是，VE样细胞中检测到Cer1表达，表明远端 visceral endoderm（DVE）/前端 visceral endoderm（AVE）起始形成。去除任何单一组分都会导致谱系标记基因表达异常，证实各信号通路的协同作用。

植入后胚胎样结构完成原肠胚形成

将E5.5样胚胎结构转入改良IVC1培养基悬浮培养，30.4%发育为E6.5样结构，出现扩张的原前肠腔和不对称CER1表达。继续培养2天后，42.8%的胚胎样结构形成包含羊膜（Am）、羊膜腔（AC）、外体腔（ExC）和 ectoplacental腔（EC）的复杂结构。53.6%的E7.5样结构出现T（Brachyury）阳性原始条纹，伴随E-CADHERIN下调表明上皮-间质转化。同时检测到SOX17⁺FOXA2⁺定形内胚层样细胞、FOXA2⁺T⁺轴中胚层样细胞和RUNX1⁺造血祖细胞。单细胞转录组分析揭示所有三个胚层及胚外谱系的存在，与E7.5天然胚胎细胞类型高度相关（R>0.9）。

胚胎样结构突破原肠胚期展现器官发生雏形

采用三维滚动培养系统继续培养E7.5样胚胎结构，59.6%可发育为E8.5样结构，出现卵黄囊样包裹和头褶、尾芽形态特征。免疫荧光检测到OTX2⁺前脑/中脑区域、SOX1⁺神经上皮沿前后轴分布、MHC-II⁺GATA6⁺心管样结构，以及尾部SOX1⁺T⁺神经-中胚层祖细胞。卵黄囊内发现RUNX1⁺造血祖细胞。单细胞转录组分析鉴定出25种细胞谱系，包含三个胚层的衍生物，与E8.5天然胚胎对应谱系呈现高转录相似性。

全能样细胞胚胎模型重现发育轨迹连续性

通过基因集富集分析发现，从S1到S7的胚胎样结构依次富集2细胞期、4-16细胞期、32-64细胞期、E4.5、E5.5和E7.5阶段特异性基因集。伪时间分析显示从S1到S3模拟了2细胞到64细胞的发育过渡，从S3到S7再现了植入前到原肠胚形成的连续进程。UMAP整合分析证实胚胎样结构的胚胎与胚外谱系与其S4前体细胞聚类更近，支持谱系发育的连续性。该模型成功重现了小鼠从E1.5到E7.5的胚胎发育轨迹，为研究哺乳动物胚胎发生机制提供了从合子基因组激活到器官发生起点的完整平台。