RIβ中N3A基序介导cAMP与ATP在PKA激活中的变构串扰机制研究

时间：2025年10月20日

来源：Protein Science

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本综述深入解析了蛋白激酶A（PKA）调控亚基RIβ的结构与功能机制，揭示了其特有的N3A基序（N3AA和N3AB）在介导环磷酸腺苷（cAMP）与三磷酸腺苷（ATP）变构通讯中的核心作用。研究通过结构生物学手段捕获了RIβ:C异二聚体中间态，阐明了其与全酶（R2C2）构象的动态差异，为理解脑组织中RIβ相关神经发育障碍与神经退行性疾病的分子基础提供了新视角。

1 INTRODUCTION

cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）是细胞信号转导的核心调控者，其调控亚基（R）与催化亚基（C）形成无活性的R₂C₂全酶。RIβ亚基在脑中高表达且与神经发育障碍、神经退行性疾病及癌症密切相关，但其结构与功能机制研究相对滞后。本研究通过比较RIβ全酶与RIβ:C异二聚体的结构，揭示了N3A基序在介导cAMP与ATP变构串扰中的关键作用。

2 RESULTS

2.1 Effect of AKAP binding on the RIβ holoenzyme crystals

脑组织中RIβ存在二硫键交联，氧化或AKAP肽结合可诱导晶体中核苷酸释放及构象动态化。添加RI特异性AKAP肽（smAKAP）后，晶体衍射质量下降，提示D/D域结构变化影响全酶稳定性。

2.2 Structure of the RIβ:C heterodimer

共结晶获得RIβ:C异二聚体结构（分辨率3.7 Å），其R亚基在抑制位点前发生蛋白酶解，D/D域与AKAP肽密度缺失。该结构呈现开放性激酶构象，ATP结合位点无密度，C末端螺旋未解析，表明其处于激活中间态。

2.3 N-lobe and ATP binding site in the catalytic subunit

C亚基N叶处于动态开放构象：G环部分开放，Phe54侧链密度缺失，C末端尾段（T300-F350）疏水锚定减弱，关键静电相互作用（Asp333-Arg56）及Lys72稳定性丧失，共同导致ATP结合能力下降。

2.4 Linker in RIα and RIβ is intrinsically disordered

2.4.1 Inhibitor binding site

抑制位点（伪底物）锚定于C亚基活性中心，但其P-3精氨酸侧链因ATP缺失而紊乱。RIβ中P位点为缬氨酸（Val），不同于RIα的异亮氨酸，可能减弱其与ATP的协同结合效应。

2.4.2 N-terminal and C-terminal linkers

C端连接链（C-linker）高度保守，稳定包裹于CNB-A域的B/C螺旋，通过疏水（Tyr103、Tyr111）与静电（Asp107、Arg113）相互作用固定结构，屏蔽cAMP结合位点并维持全酶抑制状态。

2.5 Dimer interfaces differ in RIβ₂C₂ and RIβ:C

全酶中ATP稳定通过C尾反平行二聚化加固，而异二聚体中CNB-A域的N3A^A形成二聚界面（Y120、K121、R144、S145参与），该界面在RIα中突变可导致激活阈值降低及希尔系数变化。

2.6 C-terminal tail in the RIβ subunit is disordered in the RIβ:C complex

CNB-B域C″螺旋（残基367-379）密度完全缺失，关键相互作用（R366-E261）断裂，W260侧链旋转。Y371（cAMP^B的腺嘌呤帽）和R370（与N3A^B的3₁₀环相互作用）溶剂暴露，表明该区域构象动态化。

2.7 Structural and functional characterization of the N3A motifs

N3A基序（αN-3₁₀-αA）为稳定刚性体，疏水核心保守。N3A^A与PBC^A及C亚基C叶形成多重界面；N3A^B的3₁₀环通过Val251、Ile253与PBC^B疏水作用稳定，但R370（RIβ特有，RIα为Gln）与Y371的功能状态在异二聚体中丧失。

2.8 Allosteric hotspots in the RIβ/RIα holoenzymes

αA^B螺旋两端的D267（与R241、R194形成变构节点）和W260（cAMP^A帽）构成R:C通讯枢纽。异二聚体中R194-D267相互作用断裂，W260侧链旋转，提示其感知cAMP结合并传递信号至CNB-A域。

3 DISCUSSION

RIβ D/D域氧化状态与AKAP结合影响全酶稳定性。N3A基序作为多价变构枢纽，协调cAMP与ATP的互斥结合：C-linker稳定抑制状态，N-linker感应ATP结合；W260构象变化可能为cAMP激活的初始步骤。RIβ与RIα在R370等关键位点的差异决定了其独特的变构调控特性，为相关疾病突变机制提供结构基础。