And-1通过调控DNA聚合酶δ协调核苷酸切除修复及UVB诱导皮肤肿瘤发生的机制研究

本研究针对核苷酸切除修复(NER)晚期步骤中DNA缺口填充合成的调控机制不明确的问题，开展了关于DNA复制修复因子And-1在UVB诱导DNA损伤修复中的作用机制研究。研究人员发现And-1通过T826位点磷酸化增强与损伤DNA和Pol δ-p125的相互作用，促进修复复合体招募并增强聚合酶活性。动物实验证实And-1磷酸化缺陷小鼠表现出NER功能受损和角化棘皮瘤易感性增加。该研究揭示了NER修复合成的新调控机制，为皮肤肿瘤防治提供了新靶点。

当阳光中的紫外线照射到皮肤细胞时，会在DNA上形成一种称为"光产物"的损伤，其中最主要的是环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)和嘧啶(6-4)嘧啶酮光产物(6-4PPs)。这些损伤如果得不到及时修复，就会导致基因突变，最终可能引发皮肤肿瘤。在哺乳动物中，核苷酸切除修复(NER)通路是清除这些UVB诱导的光产物的主要机制。

虽然NER的早期步骤已经被研究得比较清楚，包括损伤识别、DNA解旋和损伤链的切除，但最后一个关键步骤——DNA缺口填充合成——的调控机制却仍然知之甚少。这个步骤需要DNA聚合酶在切除了损伤片段的缺口处进行合成，以恢复DNA的完整性。特别是关于哪些因子负责招募和调控DNA聚合酶在损伤位点进行修复合成，以及这一过程在体内如何影响肿瘤发生，都是亟待解答的重要问题。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员将目光投向了一个名为And-1（也称为WDHD1或Ctf4）的DNA复制和修复因子。And-1是一个从真菌到脊椎动物中都高度保守的酸性核质DNA结合蛋白，包含三个主要结构域：N端的WD40重复域（作为蛋白质相互作用支架）、中央的SepB域（介导蛋白质-蛋白质相互作用）和C端的HMG域（通过DNA结合促进染色质结合）。

为了探究这一科学问题，研究人员运用了多种关键技术方法：通过免疫荧光和染色质分级分析研究蛋白质定位；利用质谱分析和免疫共沉淀鉴定蛋白质相互作用；采用ELISA法检测DNA损伤修复效率；通过非程序性DNA合成(UDS)评估修复合成能力；使用体外DNA结合和聚合酶活性分析研究分子机制；并构建了And-1磷酸化缺陷基因敲入小鼠模型进行体内功能验证。

And-1是修复UVB诱导DNA损伤的关键因子

研究人员首先发现，在UVB照射后，And-1会聚集到UV损伤位点，与CPDs和6-4PPs共定位。当抑制And-1表达时，细胞清除光产物的能力显著下降，细胞在UVB照射后的存活率也明显降低。这些结果首次证明And-1参与了UVB诱导DNA损伤的修复过程。

And-1通过与NER因子相互作用招募Pol δ-p125至UV损伤位点

通过质谱分析，研究人员发现And-1与多个NER因子相互作用，特别是与DNA聚合酶δ的催化亚基p125直接结合。进一步实验表明，And-1通过增强p125与PCNA（增殖细胞核抗原）的相互作用，促进p125及其调节亚基p66招募到染色质上的UV损伤位点，从而促进修复合成。

And-1的T826磷酸化对其NER功能至关重要

研究人员发现，ATR激酶介导的And-1 T826位点磷酸化对其功能至关重要。磷酸化的And-1在UVB照射后更多地聚集在损伤位点，并且能更有效地促进p125的招募和修复合成。重要的是，只有野生型And-1，而非T826A磷酸化缺陷突变体，能够恢复And-1缺失细胞中的修复功能。

And-1磷酸化调控其分子内相互作用及与损伤位点的结合

机制研究表明，And-1的SepB结构域负责与p125相互作用，而HMG结构域负责与损伤DNA结合。UVB诱导的T826磷酸化会破坏SepB和HMG结构域之间的分子内相互作用，使And-1能够同时结合损伤DNA和p125，从而促进修复复合体的组装。

And-1在体外增强p125的聚合酶活性

体外实验证实，And-1对单链DNA、DNA泡状结构和缺口DNA有较强亲和力。更重要的是，And-1能增强p125与缺口DNA的结合，并提高其聚合酶活性和持续性。这种促进作用依赖于And-1的磷酸化状态，因为从UVB照射细胞中纯化的野生型And-1比T826A突变体更能促进p125的活性。

And-1 T819磷酸化对小鼠皮肤表皮中的NER至关重要

为了验证And-1磷酸化的生理意义，研究人员构建了对应于人类T826位点的小鼠And-1 T819A磷酸化缺陷敲入小鼠。在小鼠表皮角质形成细胞中，T819A突变显著损害了p125在UVB照射后向染色质的招募，并降低了光产物的清除效率。

And-1磷酸化缺陷小鼠对UVB诱导的皮肤肿瘤发生更敏感

长期UVB照射实验表明，所有Wdhd1T819A小鼠在25周后都出现了多个大小不一的肿瘤，而野生型小鼠仅有一只出现单个小肿瘤。组织学分析显示这些肿瘤均为角化棘皮瘤，其中一些还显示出恶性进展的早期迹象，表明And-1磷酸化缺陷会显著增加UVB诱导皮肤肿瘤的易感性。

该研究系统阐明了And-1通过T826位点磷酸化调控NER晚期步骤中缺口填充合成的新机制。And-1作为分子支架，通过协调p125、p66和PCNA的招募和活化，确保修复合成的高效进行。更重要的是，研究人员利用基因编辑小鼠模型证实了And-1磷酸化在防止UVB诱导皮肤肿瘤中的关键作用。

这些发现不仅深化了对DNA损伤修复机制的理解，而且为皮肤癌的预防和治疗提供了新的分子靶点。由于CPDs是UVB诱导皮肤肿瘤发生的主要驱动因素，而And-1正是促进CPDs高效修复的关键因子，针对And-1通路的调控可能成为未来皮肤癌防治的新策略。研究还提示，在皮肤鳞状细胞癌中And-1存在较高突变率，进一步支持了其与皮肤肿瘤发生的潜在联系。

这项工作的意义在于它将分子机制与生理功能紧密联系，从细胞水平到动物模型全面解析了And-1在NER和肿瘤抑制中的作用，为理解DNA修复与肿瘤发生的关系提供了新的视角。未来的研究可以进一步探索如何利用这一发现开发新的皮肤癌预防策略，以及And-1在其他类型DNA损伤修复中的可能作用。