单颗粒基因组学从纳升级海水中揭示丰富的非经典海洋病毒

本研究针对海洋病毒多样性捕获方法受限的瓶颈，开发了环境微区室基因组学(EMCG)技术，通过对300纳升海水样本中2,037个颗粒进行单颗粒基因组测序，成功发现了大量未被传统宏基因组学检测到的Naomiviridae家族非经典DNA病毒，这些病毒使用脱氧尿苷(dU)替代脱氧胸苷(dT)，揭示了海洋病毒圈中此前被忽视的重要生态类群。

海洋中微观生命的世界充满了神秘，其中病毒作为最丰富的生物实体之一，在海洋生态系统中扮演着关键角色。然而，传统的研究方法在揭示海洋病毒的完整多样性方面面临着巨大挑战。宏基因组学虽然能够提供病毒群落的整体视图，但由于病毒的高度微多样性和频繁的基因横向转移，获得的病毒宏基因组组装基因组(vMAGs)往往片段化且不完整。而基于荧光激活病毒分选(FAVS)的单病毒基因组学虽然能够获得更完整的病毒基因组，但通量低且受限于光学检测灵敏度，难以捕获小型病毒颗粒。

在这项发表于《Nature Microbiology》的研究中，研究人员开发了一种名为环境微区室基因组学(EMCG)的革命性技术，为海洋病毒研究开辟了新途径。该技术通过将样品中的颗粒随机分隔到皮升级的半透性胶囊(SPC)中，在每个胶囊内进行DNA扩增和条形码标记，实现了从极小样品体积（仅300纳升海水）中高效获取数千个单颗粒基因组序列。

关键技术方法包括：使用半透性胶囊(SPC)对海水样本进行微区室化处理；在胶囊内进行碱性裂解和全基因组扩增(WGA-X)；组合条形码标记技术实现单颗粒追踪；Illumina测序和生物信息学分析。样本来自2022年4月18日美国缅因湾布思贝港采集的海水。

颗粒捕获的定量与鉴定

研究人员开发并试用了EMCG方法，该方法基于将水样分隔在SPCs内。通过分析300纳升缅因湾海岸海水样本，获得了2,037个单扩增基因组。基于SPC占据率和测序emSAGs的分类注释，估计原核浮游生物细胞和DNA病毒样颗粒的丰度分别为1.93×10⁹ L^-1和1.79×10¹⁰ L^-1，与流式细胞计数结果高度一致，表明emSAGs能够以随机取样、整体性的方式定量代表分析样本中的DNA颗粒。

对emSAGs进行初步分类显示，病毒样emSAGs占主导地位（1,791个），细胞样emSAGs为193个，比例为9:1，与海洋表面病毒与细胞的平均比例相符。细胞样emSAGs的分类组成与同一样本中原核浮游生物cSAGs相似，且与同一海岸位置的既往研究一致。

病毒样基因组组装的质量

病毒样基因组序列的质量在三种方法间存在差异。病毒样emSAGs的平均长度（27 kbp）是vMAGs（2 kbp）的10倍以上，但低于vSAGs（56 kbp）。CheckV评估显示emSAGs中高质量和中等质量基因组组装的比例（54%）高于宏基因组重叠群（1%）和vSAGs（22%），表明EMCG在回收高质量基因组方面优于宏基因组学和FAVS。

通过网络分析将emSAGs和vMAGs聚类为病毒操作分类单元(vOTUs)，结果显示大多数emSAGs和vMAGs不与其他基因组组装聚类，而多成员集群中最常见的配置是多个vMAGs与单个emSAG聚类，反映了emSAGs组装完整性远高于vMAGs。

非经典DNA颗粒的意外丰度

研究意外发现，含有emSAGs的大型病毒样基因组集群(vOTUs)与病毒宏基因组读数比例相关性较弱，且emSAGs数量最多的vOTU（26个）没有招募到任何病毒宏基因组读数，也没有vMAG成员。这表明病毒emSAGs和vMAGs组成的差异不仅由宏基因组组装片段化引起，还与获取的DNA来源不同有关。

进一步分析显示，这些缺乏宏基因组代表性的丰富vOTU属于VC1099集群，包含Naomiviridae科的Noahvirus属培养病毒。1.8%的病毒样emSAGs（相当于样本中丰度约3×10⁸ L^--1）聚类到VC1099，表明EMCG发现了一个与Noahvirus相关的丰富病毒谱系，而传统病毒宏基因组学无法检测到这些病毒。

Noahvirus独特地使用非经典核苷酸dU替代dT，其基因组只能在phi29聚合酶帮助下产生经典DNA拷贝后才能测序。EMCG工作流程涉及使用phi29聚合酶扩增单个颗粒的gDNA，这解释了Naomiviridae在emSAGs中的回收。而病毒宏基因组测序没有进行预扩增，因为预扩增会在混合群落鸟枪法测序中引入严重偏差。

对VC1099 emSAGs所有contigs进行共组装产生了两个环化共组装，长度约62 kbp，与已发表的Noahvirus分离株基因组长度相似。比对分析揭示了单个Naomiviridae颗粒间高频率的核苷酸水平变异。通过搜索与两个VC1099共组装相似的contigs，在细胞SAGs中发现与Naomiviridae相关的小片段对齐，表明其可能感染海洋中最丰富的浮游细菌谱系，包括Rhodobacteraceae科的Amylibacter和Pelagibacteraceae科的Pelagibacter。

研究结论与意义

环境微区室基因组学(EMCG)作为一种新型方法，为环境样品中单个细胞和细胞外遗传元素的高通量、定量基因组测序提供了新平台。该方法通过对样品中的颗粒进行随机区室化，无需复杂昂贵仪器即可实现数千个颗粒的测序，显著提高了分析通量并降低了设备成本。

研究最重要的发现之一是揭示了海水中Naomiviridae的丰富度，并表明它们感染几种最丰富的海洋浮游细菌谱系。这些病毒使用dU代替dT的非经典DNA修饰，可能帮助病毒逃避宿主免疫系统的检测。研究结果表明，具有非经典DNA的病毒在特定海洋区域可能非常丰富，并在海洋微生物生态学中扮演关键角色，然而标准宏基因组学方法无法检测到这些病毒。

EMCG技术为海洋和其他环境中病毒和其他细胞外遗传元素的定量基因组内容分析提供了新机会。对海水中Naomiviridae普遍性的发现反映了提高我们对具有非经典DNA的细胞外遗传元素的丰度、生态作用和生物技术潜力理解的重要性。EMCG从亚微升样品体积中以单个颗粒分辨率解析病毒和微生物基因组内容的能力，也可能在环境微生物学之外的领域找到应用，如感染诊断和法医学。