靶向GFER：双重调控氧化还原稳态与重启免疫应答以攻克胰腺导管腺癌的新策略
摘要
胰腺导管腺癌(PDAC)是一种极具侵袭性的癌症，其5年生存率极低，对免疫检查点阻断(ICB)疗法具有显著的耐药性。这种耐药性源于其独特的免疫抑制性肿瘤微环境(TME)。代谢重编程，特别是线粒体功能障碍，是塑造PDAC免疫抑制TME的关键因素之一。本研究旨在通过鉴定一个能够同时破坏癌细胞氧化还原稳态并增强其免疫原性的靶点，为克服PDAC治疗困境提供新策略。研究人员首先通过定制的单引导RNA(sgRNA)文库进行CRISPR-Cas9筛选，在PDAC患者来源异种移植(PDX)模型中系统性地寻找对肿瘤生长至关重要的线粒体代谢依赖基因。功能性验证分析揭示，线粒体FAD依赖性巯基氧化酶——生长因子、内质网1(GFER)，是调控PDAC肿瘤生长的关键因子。体内外实验证实，GFER的缺失扰乱了细胞的氧化还原平衡，并显著刺激了肿瘤的免疫原性，包括对ICB治疗的敏感性增强。在PDAC的PDX模型中，GFER缺失所诱导的生长抑制效应是通过改变氧化平衡介导的，这种改变导致受损的线粒体DNA(mtDNA)释放到肿瘤细胞的细胞质中，进而激活cGAS-STING通路并表达I型干扰素(IFN)。这一效应在小鼠免疫正常的同源PDAC模型中得以重现，其中GFER缺失抑制了肿瘤生长，并促进了T细胞浸润，从而增强了肿瘤杀伤效果。最终，GFER缺失显著增强了ICB疗法的抗肿瘤疗效。这些发现共同确立了GFER作为PDAC中线粒体氧化还原稳态和免疫调节的关键节点，并为使PDAC对ICB治疗敏感化揭示了一个新的治疗机会。
引言
PDAC是一种高度恶性的癌症，其5年生存率约为8%。ICB疗法虽然已成功改变了其他多种侵袭性癌症的治疗格局，但对PDAC的疗效有限。这种耐药性主要归因于PDAC独特的免疫抑制性TME。PDAC的TME以免疫细胞、基质成分和癌细胞衍生因子之间复杂的相互作用为特征。癌基因如突变的c-MYC和KRAS（后者在超过90%的PDAC病例中被检出）会募集免疫抑制性髓系细胞和调节性T细胞(Treg)，从而抑制抗原识别级联反应并激活癌症相关成纤维细胞(CAF)。这些成分共同作用，通过建立一个保护PDAC细胞免受免疫监视的免疫抑制性生态位，来抑制细胞毒性T细胞的活性。尽管近期在克服PDAC TME挑战方面已有诸多努力，例如靶向突变KRAS的疗法可通过募集T细胞和自然杀伤(NK)细胞到PDAC TME中来引发免疫反应，从而增强这种典型的“冷”肿瘤的免疫原性，但这类疗法常因快速出现的获得性耐药而受限，这凸显了寻找不同机制以克服或逆转PDAC免疫抑制TME的紧迫性。代谢重编程是PDAC细胞高增殖率和强大生存机制的特征，并有助于塑造PDAC的免疫抑制TME。线粒体作为细胞过程中的关键信号枢纽，已被确定为PDAC治疗耐药和TME重编程的重要贡献者。功能失调的线粒体会损害细胞能量和氧化还原平衡，并影响参与PDAC进展的关键信号通路。代谢重编程、线粒体功能障碍和PDAC免疫抑制成分之间复杂的相互作用表明，靶向线粒体可能会增强免疫原性，从而使PDAC细胞暴露于免疫监视之下。本研究发现，GFER是一个线粒体因子，其抑制既能改变胰腺癌细胞的氧化还原稳态，又能增强免疫系统对癌细胞的识别。GFER在线粒体过程中扮演着关键角色，包括线粒体蛋白质折叠和铁-硫簇(ISC)的转运。此外，GFER是电子传递链(ETC)的电子供体，而ETC是氧化磷酸化(OXPHOS)所必需的，从而为正常细胞功能供能。然而，GFER在肿瘤生长中的作用尚不明确。本研究证明，GFER抑制会增加TME中适应性免疫反应的成分，从而揭开了被TME“伪装”起来的PDAC细胞，使其暴露于免疫系统。TME中的这些变化使PDAC细胞对ICB治疗敏感，从而将GFER定位为增强PDAC治疗反应的一个有前景的候选靶点。
结果
通过MITO文库的汇集式CRISPR筛选揭示GFER是PDAC的关键依赖因子
为探索线粒体在PDAC细胞增殖中的作用，研究团队建立了一个靶向1,166个核编码线粒体基因的sgRNA文库，并在三个来源于早期传代PDAC PDX模型的细胞系中进行了CRISPR-Cas9基因敲除筛选。通过这种方法，他们鉴定出多个对PDAC细胞生长至关重要的基因，这些基因与线粒体氧化还原系统和特定的线粒体代谢相关。为在体内功能验证这些候选基因，研究人员将靶向前五个候选基因的sgRNA与多西环素诱导型CRISPR-Cas9载体一同导入PDX来源的细胞，随后将这些细胞植入免疫缺陷小鼠。移植后，启动多西环素治疗以诱导CRISPR介导的GFER、GPX4、NFS1、ABCB7或SOD1基因敲除。尽管敲除其他四个基因也观察到了生长抑制反应，但在GFER缺失的PDAC肿瘤中观察到了最强的生长抑制效应。GFER缺失并未显著改变这些相关氧化还原或线粒体基因的表达。因此，研究人员选择GFER进行深入研究。GFER已被报道在肝癌细胞系中参与线粒体代谢和ETC，但其在调控肿瘤生长中的作用尚不清楚。为深入了解GFER在PDAC中的作用，研究团队用sgGFER或对照sgCTRL转染了PDX来源的PATC124和PATC148细胞，并发现GFER缺陷导致PDAC细胞的克隆形成和成球能力显著下降。一致地，在异种移植模型中，观察到GFER缺失显著抑制了肿瘤生长，而这种抑制效应可被表达sgRNA抗性GFER所挽救。综合来看，这些数据提供了强有力的证据，表明GFER缺失影响PDAC生长。鉴于GFER在癌症依赖图(DepMap)数据库的大多数癌细胞系中都被评分为一类必需基因，研究团队测试了GFER敲除对正常胰腺细胞的影响，发现与转化细胞相比，GFER缺失不影响正常胰腺细胞的生长。此外，与正常胰腺组织相比，GFER在小鼠胰腺上皮内瘤变和胰腺肿瘤中的表达显著升高，这表明正常胰腺组织对GFER的依赖性可能低于肿瘤组织。
GFER缺陷损害线粒体功能并诱导PDAC细胞周期阻滞
与其在维持ETC功能中的作用一致，在PATC细胞中敲除GFER降低了线粒体耗氧率(OCR)，并伴随线粒体活性氧(ROS)水平的显著升高。由于GFER通过其在ISC输出中的作用间接影响线粒体基质和细胞质中的多种细胞活动，研究团队评估了GFER缺失对细胞质顺乌头酸酶活性和GPAT蛋白水平的影响。研究发现，在两种GFER缺陷的PATC细胞中，细胞质顺乌头酸酶活性和GPAT蛋白水平均显著降低，这表明GFER是PDAC细胞中ISC输出及相关功能所必需的。接下来，为理解GFER缺陷对PDAC细胞生长的抑制效应是由于诱导了细胞死亡和/或抑制了细胞周期进展，研究团队观察到GFER缺失并未诱导程序性细胞死亡；相反，它与G1期细胞的积累和S期细胞的急剧减少相关。进一步的证据表明，GFER缺失增加了DNA损伤标志物γH2AX和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的表达水平，表明细胞周期阻滞可能是由诱导的DNA损伤和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制所导致的。此外，长期的GFER缺失会诱导一种类似衰老的表型，其特征是β-半乳糖苷酶染色增加且对吉西他滨的敏感性降低。综合来看，体外研究表明，GFER缺陷对PDAC细胞生长的抑制作用可能是通过损害PDAC线粒体功能、增加线粒体氧化应激和细胞周期阻滞来介导的。
GFER缺陷通过干扰谷胱甘肽通路破坏氧化还原稳态
为阐明GFER缺失对PDAC细胞抗增殖作用的分子机制，研究团队对GFER缺陷和表达的PATC细胞进行了批量RNA测序(RNA-seq)。分析揭示了与线粒体功能和细胞周期进展相关的关键通路显著下调，这与之前证明GFER缺陷导致线粒体功能障碍和细胞周期阻滞的数据一致。值得注意的是，在GFER缺陷的PDAC细胞中，未折叠蛋白反应(UPR)通路被上调，这一点通过GFER缺失后PDAC细胞中所有线粒体UPR相关基因表达增加得到了证实。差异基因表达分析揭示了在GFER缺失72小时后，PDX细胞中大量基因表达上调。在这些上调的基因中，观察到谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰环转移酶1的表达增加，它通过催化GSH的裂解来维持细胞内的氧化平衡，并作为促凋亡因子参与UPR。为评估CHAC1在介导GFER缺陷抗增殖效应中的作用，研究团队在GFER缺陷和表达的PATC细胞中敲除了CHAC1。尽管单独敲除CHAC1并未显著影响集落形成，但在GFER缺失的背景下敲除CHAC1可部分挽救集落形成。正如基于CHAC1表达增加所预期的那样，在GFER缺陷的PDAC细胞系中观察到GSH水平显著降低。为阐明GSH耗竭在GFER下调后对PDAC生长的影响，研究人员向PDX PATC细胞提供了外源性GSH，这减轻了GFER缺失的抗增殖效应。GSH补充挽救了GFER缺陷以及GFER/CHAC1双敲除细胞的增殖。这些发现共同表明，通过CHAC1调节GSH稳态对于GFER介导的人PDAC细胞生长控制至关重要。
GFER缺失对免疫正常PDAC模型中免疫环境组成的影响
由于肿瘤细胞的代谢重编程已被证明可以改变免疫抑制的PDAC TME，接下来研究团队调查了GFER缺失对PDAC免疫微环境的影响。有趣的是，RNA-seq分析揭示了GFER缺失后，包括IFNα、IFNγ、TNFα信号、炎症反应和IL2–STAT5信号在内的几种免疫相关通路上调，这暗示了GFER在免疫调节中的潜在作用。为深入研究这一点，研究团队在免疫正常的小鼠模型中，使用来源于KRASG12D， Trp53R172H， p48-Cre小鼠模型的肿瘤细胞进行了GFER敲低(KD)或敲除(KO)实验。与在人细胞中的数据一致，在KPC细胞中敲低GFER导致集落形成显著减少。随后，研究团队将GFER-KD或表达的KPC细胞原位植入C57BL/6小鼠。对来自GFER-KD模型的肿瘤进行的转录组学分析显示，与对照组相比，与免疫反应相关的基因和信号通路上调。此外，观察到与T细胞浸润相关的多种趋化因子（如CXCL10和CXCL11）在GFER-KD肿瘤中表达增加。一致地，对原位KPC肿瘤进行的流式细胞术免疫分型显示，在GFER-KD肿瘤中，CD8+T细胞（占CD45+细胞的比例），特别是活化的CD8+T细胞显著增加，而其他免疫细胞亚群，包括CD4+T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞则保持不变。CD8+T细胞的细胞毒活性通过免疫荧光分析得到进一步证实，该分析显示CD8+T细胞浸润与GFER-KD肿瘤中的肿瘤细胞死亡高度相关。值得注意的是，与对照组相比，GFER-KD肿瘤中成纤维细胞的比例显著降低，这表明GFER缺失改变了基质的组成。为了解CD8+T细胞在GFER-KD介导的肿瘤生长抑制中的作用，研究团队在携带GFER-KD KPC肿瘤的小鼠中使用了抗CD8抗体来耗竭CD8+T细胞。CD8+T细胞的耗竭显著减弱了GFER-KD的抗肿瘤效果，这表明CD8+T细胞是GFER缺失发挥抗肿瘤作用所必需的。鉴于GFER-KD肿瘤中免疫活化增强，研究团队测试了GFER缺失是否能增强PDAC对ICB治疗的反应。在皮下KPC肿瘤模型中，虽然抗PD-1单药治疗对肿瘤生长影响甚微，但GFER-KD与抗PD-1联合治疗显著抑制了肿瘤生长，其效果优于任一单药治疗。重要的是，在GFER-KD背景下，抗PD-1治疗进一步增加了肿瘤内CD8+T细胞和活化的CD8+PD-1+Granzyme B+T细胞的浸润。临床相关性方面，研究人员分析了癌症基因组图谱(TCGA)数据集，发现GFER高表达的PDAC患者总体生存期更短。此外，在PRINCE临床试验的接受抗PD-1/抗CD40治疗的患者中，GFER低表达的患者表现出更长的总生存期趋势。这些数据共同表明，GFER是PDAC的不良预后标志物，并且GFER低表达可能预示着对ICB治疗有更好的反应。
GFER缺失通过mtDNA-cGAS-STING通路激活先天免疫
鉴于GFER缺失上调了I型IFN信号通路，研究团队探究了其潜在的分子机制。在GFER缺陷的PDX细胞中，观察到胞质mtDNA水平显著增加，这可能导致DNA传感通路cGAS-STING的激活。与此一致，在GFER缺陷的PDX细胞中检测到STING及其下游效应物TBK1的磷酸化水平升高，以及I型IFN的表达增加。为验证cGAS-STING通路在GFER缺失介导的免疫激活中的作用，研究团队使用了STING拮抗剂H-151。H-151处理有效地阻断了GFER-KD诱导的I型IFN产生，并部分逆转了GFER-KD在体外对PDX细胞生长的抑制作用。更重要的是，在体内，H-151处理显著削弱了GFER-KD的抗肿瘤效果，并减少了肿瘤内CD8+T细胞的浸润。这些结果表明，GFER缺失通过释放mtDNA激活cGAS-STING-I型IFN轴，从而驱动抗肿瘤免疫。为探究GFER缺失导致的氧化还原失衡与cGAS-STING通路激活之间的联系，研究团队测试了抗氧化剂能否逆转免疫激活。用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ或外源性GSH处理GFER缺陷细胞，可减少线粒体ROS的产生，抑制cGAS-STING通路的激活，并部分挽救细胞生长。这些数据表明，GFER缺失导致的氧化还原失衡是mtDNA释放和随后的先天免疫激活的上游事件。
讨论与总结
本研究通过系统的功能基因组学筛选，将线粒体酶GFER鉴定为PDAC的一个新的治疗脆弱性靶点。GFER缺失通过双重机制发挥抗肿瘤作用：一方面，它破坏肿瘤细胞自身的氧化还原稳态，导致线粒体功能障碍、GSH耗竭和细胞周期阻滞；另一方面，它通过释放mtDNA激活cGAS-STING-I型IFN先天免疫通路，重塑免疫抑制性TME，增强CD8+T细胞浸润和活化，从而使“冷”的PDAC肿瘤对ICB治疗敏感。这项研究的意义在于揭示了一个单一的分子靶点GFER，能够同时调控癌细胞的代谢适应性和免疫逃避能力。靶向GFER或其下游通路（如CHAC1/GSH轴或cGAS-STING轴）可能为PDAC提供一种新的联合治疗策略。特别是，将GFER抑制与现有的ICB疗法相结合，有望克服PDAC对免疫治疗的耐药性，为这种致命性疾病带来新的希望。未来的研究需要开发特异性的GFER小分子抑制剂，并在更广泛的临床前模型和临床试验中验证其疗效与安全性。
