谱系限制性干细胞对人类造血的稳定克隆贡献揭示造血干细胞命运决定新机制

本研究通过追踪健康老年人克隆性造血（CH）突变，首次揭示了人类造血干细胞（HSC）克隆在稳态造血中具有稳定且独特的谱系贡献模式。研究人员发现除了贡献全部五系（PEMBT）的多能HSC外，还存在仅贡献髓系-红系-巨核系- B细胞（PEMB）或仅贡献髓系（PEM）的谱系限制性HSC克隆，且这些模式在数十年间保持稳定。该研究利用错误校正靶向测序（ECTS）、单细胞衍生克隆全基因组测序（WGS）和微滴数字PCR（ddPCR）等技术，证明HSC的谱系限制性是由其内在程序决定的，而非由CH驱动突变主导。这一发现对理解造血发育、衰老及相关血液疾病具有重要意义。

在人体这个精密的生命机器中，每秒钟都有数百万血细胞被更新，这个过程由造血干细胞（HSC）持续不断地分化补充来维持。然而，关于人类HSC在稳态造血过程中如何贡献不同血细胞谱系的问题，长期以来缺乏直接证据。以往的研究只能在单个时间点观察HSC克隆的贡献，且未能同时评估关键的红系和血小板谱系。更重要的是，由于人类体内存在5万-20万个活跃贡献的HSC，追踪单个HSC克隆的命运变得异常困难。

随着年龄增长，HSC会积累体细胞突变，其中一些突变如DNMT3A、TET2等能够赋予克隆生长优势而不影响血细胞发育，这种现象称为克隆性造血（CH）。这为研究者提供了一个独特的机会——利用这些突变作为天然标记来追溯扩展HSC克隆的谱系贡献。

在这项发表于《Nature Genetics》的研究中，Tetsuichi Yoshizato等科学家对93名健康老年人（24-91岁，多数≥70岁）的骨髓样本进行了深入分析。他们通过错误校正靶向测序技术（ECTS）筛查了23个CH常见突变基因，在71名个体中鉴定出211个体细胞CH驱动突变。随后利用高灵敏度的微滴数字PCR（ddPCR）技术，对纯化的HSC、各谱系祖细胞和成熟血细胞进行突变检测，追踪了57个HSC来源克隆的谱系贡献。

研究团队发现HSC克隆仅表现出三种稳定的谱系贡献模式：平衡贡献全部五系血细胞（血小板、红细胞、髓系细胞、B细胞和T细胞，称为PEMBT模式）；贡献所有髓系谱系但不贡献或极少贡献T细胞（PEMB模式）；以及仅贡献髓系谱系（血小板、红细胞和髓系细胞，称为PEM模式）。值得注意的是，约44%的克隆表现为PEMB限制或偏倚，23%为PEM限制或偏倚，而仅有26%显示平衡的多系贡献。

为了探究这些谱系限制模式是否由CH驱动突变引起，研究人员进行了系统发育分析。通过单细胞衍生克隆的全基因组测序（WGS），他们重建了系统发育树，发现PEM限制的克隆早在数十年前就已经确立其命运决定，且这些模式在不同CH驱动突变（如DNMT3A、TET2、ASXL1等）中广泛分布，表明谱系限制并非主要由特定驱动突变决定。

特别有趣的是，研究发现DNMT3A突变的HSC克隆显著富集于PEMBT模式，这可能是因为这些克隆通常在生命早期出现，当时HSC仍能主动补充长寿的T细胞。而随着衰老，HSC逐渐失去T细胞再生能力，从而更多表现为PEMB或PEM模式。

为了确认B细胞贡献是否反映持续的B淋巴细胞生成而非长寿B细胞的持久存在，研究人员检测了克隆来源的CD34⁺CD19⁺B祖细胞（pro-B细胞）。结果显示，在有成熟B细胞贡献的HSC克隆中，pro-B细胞也存在相似的突变细胞分数（MCF），证明这是持续的B淋巴细胞生成过程。

更重要的是，移植实验证实了谱系限制是HSC内在编程的特性。将来自同一供体的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到免疫缺陷NSG小鼠后，它们保持了与在人体内相同的谱系贡献模式——能够贡献B细胞的克隆在小鼠中仍产生B细胞，而不能贡献B细胞的克隆在小鼠中也无法产生B细胞。

前瞻性分析显示，这些HSC克隆的谱系贡献模式在长达65个月的观察期内保持惊人稳定，无论是平衡的多系贡献还是谱系限制/偏倚的模式，都未随时间发生显著变化。

系统发育分析揭示了HSC克隆谱系贡献的两种演变模式："等级"模式，即后代亚克隆比祖先克隆表现出更高程度的谱系限制（从PEMBT向PEMB或PEMB向PEM演变）；和更常见的"稳定"模式，即尽管与祖先克隆分离数十年，后代克隆仍显示出高度一致的谱系贡献模式。

本研究首次在人类中全面描绘了HSC克隆在稳态造血中的谱系贡献模式，揭示了HSC存在稳定的内在谱系限制程序。这一发现不仅深化了对人类造血发育和衰老的理解，也为血液系统疾病的起源和治疗提供了重要启示。特别是这些谱系限制的HSC可能作为基因组改变的储存库，是不同谱系归属血液系统恶性肿瘤的起源细胞。

研究采用的几个关键技术方法包括：1）通过错误校正靶向测序（ECTS）技术筛查骨髓样本中的CH突变；2）利用流式细胞术分选纯化HSC、各谱系祖细胞和成熟血细胞；3）采用微滴数字PCR（ddPCR）进行高灵敏度突变定量检测；4）对单细胞衍生克隆进行全基因组测序（WGS）并重建系统发育树；5）通过免疫缺陷NSG小鼠移植模型验证HSC的谱系贡献能力。

A limited repertoire of HSC lineage replenishment patterns

研究人员通过追踪57个HSC来源克隆的谱系贡献，发现人类HSC仅表现出三种稳定的谱系贡献模式：PEMBT（平衡贡献所有五系）、PEMB（贡献髓系但不贡献T细胞）和PEM（仅贡献髓系）。这些模式在不同CH驱动突变中广泛分布，表明谱系限制并非主要由特定驱动突变决定。

Phylogenetic analysis infers stable HSC lineage replenishment

系统发育分析显示，PEM限制的克隆早在数十年前就已经确立其命运决定。研究发现HSC克隆的谱系贡献模式在系统发育树中保持稳定，后代亚克隆即使经过数十年进化，仍保持与祖先克隆高度一致的谱系贡献模式。

HSC clonal lineage restriction is intrinsically programmed

移植实验证实谱系限制是HSC内在编程的特性。将来自同一供体的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到NSG小鼠后，它们保持了与在人体内相同的谱系贡献模式，证明这种限制不是由骨髓微环境等外在因素决定的。

Prospective analysis reveals stable HSC lineage replenishment

前瞻性分析显示，22个HSC克隆家族的谱系贡献模式在长达65个月的观察期内保持稳定，无论是平衡的多系贡献还是谱系限制/偏倚的模式都未随时间发生显著变化，证明了HSC克隆命运决定的长期稳定性。

该研究得出结论，人类HSC在稳态造血中表现出稳定且可预测的谱系贡献模式，这些模式由HSC内在程序决定，并在数十年间保持稳定。除了能够贡献全部五系血细胞的多能HSC外，还存在谱系限制性的HSC群体，包括PEMB限制（贡献髓系但不贡献T细胞）和PEM限制（仅贡献髓系）的HSC克隆。这些谱系限制模式并非主要由CH驱动突变引起，而是反映了HSC固有的分化程序。

这一发现对理解造血生物学具有重要意义：首先，它揭示了人类HSC在稳态造血中的功能异质性，挑战了传统认为所有HSC都具有同等多能性的观点；其次，研究发现HSC的谱系贡献模式在数十年间保持稳定，说明HSC的分化命运是预先编程的且具有长期记忆性；最后，这些谱系限制的HSC可能成为特定血液系统疾病的细胞起源，为预防和治疗年龄相关血液疾病提供了新的思路。

研究还发现，随着衰老进程，能够贡献全部五系（包括T细胞）的HSC克隆逐渐减少，而谱系限制的HSC克隆增加，这可能是造血系统衰老的重要机制之一。值得注意的是，DNMT3A突变的HSC克隆更倾向于保持多系分化能力，这可能与它们通常在生命早期出现有关，当时HSC仍能主动补充长寿的T细胞池。

这些发现将促使科学界重新思考HSC的功能异质性及其在健康和疾病中的作用，为靶向特定HSC群体的治疗策略奠定基础。