呼吸道是人体与外界进行气体交换的第一道门户，其内部覆盖着一层特殊的细胞——它们顶端长有无数细小的、可摆动的“毛发”，我们称之为“动纤毛”。这些纤毛就像无数微小的“扫帚”，通过协调、有节律的摆动，将附着了灰尘、病原体的黏液不断地清扫出呼吸道。这套至关重要的“黏液纤毛清除系统”如果失灵，就会导致反复的呼吸道感染、鼻炎、鼻窦炎，甚至发展为支气管扩张等严重后果。这种由于动纤毛结构或功能缺陷而引发的疾病，就是原发性纤毛运动障碍（Primary Ciliary Dyskinesia, PCD），它是一种遗传异质性很高的罕见病。已知有超过50个基因的突变与PCD相关，其中许多编码构成纤毛轴丝或其调控复合体的蛋白。
在动纤毛复杂的“动力系统”中，外动力蛋白臂（Outer Dynein Arm, ODA）是产生摆动机械力的核心“马达”。而这些马达需要通过一个称为“外动力蛋白臂锚定复合体”（ODA-Docking Complex, ODA-DC）的精密结构，稳定地“停泊”在纤毛轴丝（由九对微管组成的骨架）上。ODAD1（也被称为CCDC114）基因编码的蛋白，正是ODA-DC的关键结构组分，对ODA的正确锚定和纤毛的有效摆动至关重要。尽管ODAD1的突变已被确认为PCD的致病原因之一，但其全面的致病谱及其对细胞功能的更广泛影响仍未完全阐明。特别是，其突变在非欧洲人群中的特征尚不完全清楚。本研究正是在此背景下展开，旨在深入探究ODAD1功能丧失在PCD中的具体致病机制。
为了解答上述科学问题，研究人员综合运用了多种前沿技术。首先，他们通过对中国汉族PCD患者进行遗传学分析，鉴定出新的致病性ODAD1变异。研究的核心模型是源自患者鼻上皮细胞的体外培养系统，包括原代细胞、气-液界面（Air-Liquid Interface, ALI）分化培养模型以及顶端外翻的气道类器官。功能表征方面，使用了高速视频显微镜（High-Speed Video Microscopy, HSVM）量化纤毛摆动频率和模式，利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和冷冻电子显微镜（Cryo-Electron Microscopy, Cryo-EM）在超微结构乃至近原子分辨率水平解析纤毛缺陷。机制探索上，通过定量蛋白质组学（Label-free quantitative MS）筛选差异表达蛋白，并利用免疫荧光染色、超分辨显微成像等技术观察细胞骨架和细胞极性变化。最后，通过药物干预（肌动蛋白聚合抑制剂Cytochalasin B）和基因回补（慢病毒介导的野生型ODAD1表达）实验，验证了actin失调的功能可干预性以及ODAD1缺失的直接致病性。
研究结果
1. 鉴定与PCD相关的新发和复发性ODAD1变异
研究在9名无关的中国PCD患者中鉴定出四种不同的致病性ODAD1变异，包括一个新发现纯合移码变异c.705_706insGCAG和一个复发的纯合剪接位点变异c.-41-2A>C。所有患者均表现出典型的PCD临床特征，如慢性咳嗽、鼻窦炎、支气管扩张、内脏反位（situs inversus）和低水平呼出气一氧化氮。分子生物学实验证实，这些变异导致ODAD1 mRNA和蛋白表达几乎完全缺失，属于功能丧失型变异。
2. ODAD1变异破坏PCD患者的纤毛运动功能
对患者原代鼻上皮细胞和ALI培养物的高速视频显微镜分析显示，与健康对照相比，携带ODAD1变异的纤毛摆动频率（Ciliary Beat Frequency, CBF）显著降低，摆动模式不规则、不协调，表现为严重的机械功能障碍。
3. ALI培养物中ODAD1变异纤毛存在结构缺陷
透射电镜观察发现，ODAD1缺陷的纤毛完全缺失了外动力蛋白臂，并伴有中央对（Central Pair, CP）异常和周围微管（Peripheral Tubule, PT）缺陷。冷冻电镜分析在近原子分辨率水平进一步证实，两种变异均导致ODA和ODA-DC的完全缺失，表明ODAD1对于ODA的锚定至关重要。有趣的是，不同的ODAD1变异对轴丝结构的影响存在差异：c.-41-2A>C变异保留了微管内蛋白（Microtubule Inner Proteins, MIPs）、内动力蛋白臂（Inner Dynein Arm, IDA）、辐射辐（Radial Spoke, RS）和Nexin-动力蛋白调控复合体（Nexin-Dynein Regulatory Complex, N-DRC）的结构完整性；而c.705_706insGCAG变异则显示出MIPs组装不完美以及IDA、RS、N-DRC可能错位的迹象。
4. ODAD1变异减少多纤毛细胞数量并破坏其顶端组织
扫描电镜和免疫荧光分析揭示了一个出乎意料的表型：ODAD1缺陷的ALI培养物中，多纤毛细胞（Multiciliated Cells, MCCs）的比例显著减少，残留的MCCs顶膜面积异常增大，基底体的顶端分布也变得不规则。重要的是，每个MCC内的基底体数量并未减少，表明整体基底体密度的下降是由于MCCs数量减少所致，而非单个MCC内基底体生成障碍。
5. ODAD1变异导致MCCs中肌动蛋白细胞骨架重构
定量蛋白质组学分析显示，ODAD1缺陷的细胞中，与肌动蛋白（actin）细胞骨架组装、组织和动力学相关的蛋白质显著上调。免疫荧光染色证实，在整个上皮层中发生了显著的肌动蛋白细胞骨架重构，包括顶端的肌动蛋白束异常增厚、中层的细胞边界肌动蛋白过度聚集。利用CRISPR/Cas9技术在健康供体细胞中敲除ODAD1，成功复现了患者模型中的MCCs减少和肌动蛋白异常表型，排除了患者个体遗传背景的影响。
6. 药物性肌动蛋白调节可部分恢复MCC形成和纤毛发生
为了探究肌动蛋白失调的功能意义，研究人员用肌动蛋白解聚剂细胞松弛素B（Cytochalasin B）处理ODAD1缺陷的ALI培养物。结果显示，药物处理有效减轻了异常的肌动蛋白束状聚集，并部分挽救了MCCs的数量和顶膜面积，改善了纤毛密度和组织。这表明肌动蛋白失调是ODAD1缺失的下游可干预性后果，并参与了MCCs分化受损。
7. 慢病毒介导的基因递送可挽救ODAD1变异类器官的纤毛运动功能
作为功能挽救的终极验证，研究人员通过慢病毒将野生型ODAD1导入患者来源的顶端外翻气道类器官。结果证实，外源ODAD1蛋白得以正确表达并定位于纤毛，恢复了ODA组件（如DNAH9）的轴丝定位，并成功挽救了协调的纤毛摆动，使其摆动频率恢复到接近生理水平。这直接证明了所鉴定变异的功能丧失属性，并提示基因治疗策略的潜在可行性。
结论与讨论
本研究通过在中国PCD患者中鉴定新的ODAD1功能丧失变异，并利用患者来源的细胞和类器官模型进行多维度、多层次的分析，极大地扩展了对该基因致病机制的理解。研究最重要的发现是揭示了ODAD1在PCD发病中的双重作用机制：一方面是其经典的结构角色，即作为ODA-DC的核心组分，对ODA的正确锚定和纤毛动力生成不可或缺；另一方面是一个此前未被认识的、令人意外的功能，即参与维持气道上皮细胞的肌动蛋白细胞骨架稳态，从而保障MCCs的正常分化和顶膜组织。
这种由轴丝蛋白缺陷引发的全局性细胞骨架重塑，其具体分子通路尚不完全清楚。本研究观察到ODAD1缺陷的MCCs中平面细胞极性（Planar Cell Polarity, PCP）核心蛋白VANGL1的不对称定位丢失，提示可能通过干扰PCP信号通路间接影响了肌动蛋白的组装。已知PCP通路在协调顶端肌动蛋白网络、基底体锚定和MCCs组织方面发挥关键作用。
这些发现具有重要的转化医学意义。首先，研究明确了actin失调是ODAD1相关PCD的一个新的、可药物干预的病理环节。尽管细胞松弛素B因其广谱性和毒性难以直接临床应用，但这一发现为寻找更特异的肌动蛋白动力学调节剂作为辅助治疗策略（旨在改善MCCs分化和上皮屏障功能）提供了理论依据。其次，慢病毒介导的基因回补实验成功恢复了纤毛运动，为未来开发针对ODAD1等单基因缺陷型PCD的基因治疗或基因编辑疗法提供了令人鼓舞的概念验证。总之，该研究不仅深化了对PCD这一罕见病发病机制的认识，揭示了细胞器（纤毛）与全局细胞骨架之间意想不到的功能耦联，也为开发新的治疗干预策略指出了潜在的双重靶点。本研究成果已发表在《Cell Discovery》期刊。
