APOE4等位基因向APOE2的诱导性转换改善阿尔茨海默病相关代谢特征、神经病理学和认知功能

本研究针对APOE4作为晚发型阿尔茨海默病最强遗传风险因子而APOE2具有显著保护作用这一关键科学问题，开发了可诱导的APOE4向APOE2转换的小鼠模型(APOE4s2)。研究人员通过全身性和星形胶质细胞特异性等位基因转换，证实即使短期转换也能驱动AD相关的脂质组和单细胞转录组改变，特别是在星形胶质细胞中。当与5xFAD模型杂交时，星形胶质细胞特异性E4向E2转换可改善认知、减少淀粉样蛋白病理、降低胶质增生和斑块相关载脂蛋白E。这些发现为APOE基因编辑治疗策略提供了重要临床前证据。

在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)研究领域，载脂蛋白E(apolipoprotein E, APOE)基因的多态性一直占据着核心地位。人类APOE基因存在三种常见等位基因：ε2、ε3和ε4，它们编码的蛋白异构体在AD发病风险中扮演着截然不同的角色。与常见的ε3等位基因相比，ε4等位基因可使AD风险增加高达13倍，而ε2等位基因则具有显著的保护作用，能降低高达40%的AD风险，延缓认知衰退并提高寿命。

这种巨大的风险差异背后涉及多种可能的致病机制，包括E4驱动的淀粉样蛋白和tau病理加剧、脑葡萄糖和脂质代谢功能障碍、网络连接异常以及脑血管损伤等。鉴于APOE4强大的风险特征和多重生物学效应，靶向APOE4和ApoE4蛋白已成为同时调节多条AD相关通路的有前景治疗策略。

尽管先前研究已经通过基因编辑技术在诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)中成功将ε4转化为ε3或ε2，并在体外证明了这一策略可"纠正"胶质转录组谱、脂质代谢等多种表型，但在体研究主要集中于通过病毒载体递送神经保护性E2蛋白来补充E4大脑。如何实现体内精准、可控的APOE等位基因转换，以及这种转换对AD病理的改善效果如何，仍是亟待解决的关键科学问题。

为了在临床前模型中研究APOE4向APOE2完全转换的可行性和治疗潜力，研究团队开发了一种名为APOE"转换"小鼠(APOE4s2)的基因敲入模型。这一创新模型使得研究人员能够探索等位基因转换对代谢特征、神经病理学和认知功能的全面影响，为未来基因编辑治疗策略提供重要理论基础。

研究团队主要采用了以下几种关键技术方法：首先，通过基因工程技术构建了可诱导的APOE4s2基因敲入小鼠模型，利用他莫昔芬(tamoxifen, TAM)激活的Cre重组酶系统实现时间可控的等位基因转换；其次，运用定量PCR(qPCR)和靶向质谱(MS)蛋白质组学分析验证等位基因转换效率；第三，采用非靶向液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行脂质组学分析；第四，利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术全面解析脑组织细胞类型特异性转录组变化；最后，通过免疫组织化学、ELISA和行为学测试等多种手段评估AD相关病理和认知功能改变。所有实验均使用C57BL/6N背景的小鼠，包括人源化APOE2和APOE4靶向替换(TR)小鼠作为对照。

APOE"转换"小鼠高效实现从E4到E2的过渡

研究人员构建了APOE4s2^loxP/loxP小鼠，其表达带有人类APOE4的floxed编码区(外显子4)，后接人类APOE2的外显子4。将他莫昔芬处理的APOE4s2^G小鼠与Cre阴性同窝小鼠及人源化APOE2和APOE4 TR小鼠进行比较，通过等位基因鉴别图和靶向质谱蛋白质组学分析证实，在肝脏和大脑中均实现了从APOE4到APOE2 mRNA和蛋白水平的高效转换，大脑中84-93%的ApoE肽段和血浆中92-99%的ApoE肽段均转换为E2特有肽段。

全身性转换导致"E2样"代谢特征

研究人员发现，APOE4s2^G小鼠在西方饮食喂养后，血浆极低密度脂蛋白(VLDL)甘油三酯(TG)和血浆ApoE水平显著升高，达到E2-TR小鼠水平。大脑ApoE水平也相应升高，且主要与星形胶质细胞共定位。非靶向脂质组学分析显示，APOE4s2^G小鼠与对照组相比有14种脂质物种丰度存在显著差异，其中多数为甘油磷脂，包括多种磷脂酰胆碱(PC)和神经酰胺(CER)物种。加权基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定出一个与E4向E2转换显著相关的共表达模块，主要由PC和磷脂酰乙醇胺(PE)物种组成。

全身性转换驱动AD相关转录组变化

单细胞RNA测序分析显示，1个月的APOE4向APOE2转换主要影响星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞。差异表达基因分析发现，转换相关基因与E2-TR versus E4-TR小鼠的差异基因存在显著重叠，表明许多区分E4"终身"表达的基因具有急性可塑性。基因本体论(GO)分析显示，转换相关差异基因主要富集于代谢相关通路，包括底物转运、氧化还原管理和细胞呼吸等。这些差异基因还强烈反映了多个APOE相关和AD相关基因列表，特别是来自公共人类转录组数据集的晚发型AD(LOAD)基因。

仅星形胶质细胞向E2转换驱动相似基因表达

考虑到种系全身性APOE编辑可能存在的转化担忧，研究人员构建了星形胶质细胞特异性APOE4s2小鼠(APOE4s2^A)。通过细胞分选和qPCR验证了星形胶质细胞特异性E4向E2转换的高效性和细胞特异性。差异表达基因分析显示，星形胶质细胞特异性转换主要影响的细胞类型与全身性模型相似，且与LOAD基因列表高度重叠。值得注意的是，在APOE4s2^A小鼠中继续表达E4的细胞类型(如小胶质细胞、少突胶质细胞)仍显示大量差异基因，表明星形胶质细胞来源的E2存在非细胞自主性效应。

星形胶质细胞E4向E2转换降低淀粉样斑块负荷

将APOE4s2^A小鼠与5xFAD AD模型杂交，在他莫昔芬诱导转换2个月后，4s2^A/FAD小鼠显示情境记忆和提示记忆改善，总淀粉样蛋白水平显著降低。解剖学分析显示海马体、嗅觉区和丘脑的斑块负荷减少最为明显。ELISA定量显示4s2^A/FAD大脑中可溶性和不可溶性Aβ₄₂和Aβ₄₀均减少。尽管在雌性对照小鼠中观察到较高的淀粉样斑块负荷，但未检测到其他淀粉样蛋白依赖性性别差异。

星形胶质细胞E4向E2替换降低斑块相关胶质增生

除了实质淀粉样斑块负荷减少外，4s2^A/FAD小鼠的GFAP水平也显著降低。尽管只有星形胶质细胞转换为E2表达，但小胶质细胞IBA1阳性也显著减少，再次表明ApoE2的非细胞自主性效应。区域分析显示海马体、丘脑和皮质区域的GFAP和IBA1水平下降最为明显。斑块邻近性分析显示，4s2^A/FAD小鼠在靠近斑块中心处GFAP和IBA1减少更为显著。

E4向E2转换减少反应性小胶质细胞和斑块ApoE

研究人员通过测量主要组织相容性复合体II类(MHC-II)发现，4s2^A/FAD小鼠总MHC-II阳性区域减少，MHC-II阳性IBA1阳性细胞与淀粉样斑块的共定位降低，表明活化反应小胶质细胞(ARM)减少。虽然稳态基因表达无变化，但星形胶质细胞特异性转换为E2后，包括Trem2、Clec7a和APOE在内的几个疾病相关小胶质细胞(DAM)基因表达降低。尽管总ApoE蛋白水平无差异，但斑块相关ApoE存在显著差异。表达E4的对照小鼠在斑块核心周围显示明亮的ApoE染色光环，而这些强烈的斑块相关ApoE信号在4s2^A/FAD小鼠中基本消失。ELISA定量支持这些发现，4s2^A/FAD小鼠不溶性(斑块相关)脑组分中ApoE显著减少，但可溶性ApoE无差异。

本研究描述了一种新的APOE"转换"模型(APOE4s2)，该模型允许诱导性、细胞特异性、体内替换高风险APOE4等位基因为保护性APOE2变体。研究结果表明，即使是短期、发育后从E4向E2的转换，也足以广泛影响大脑转录组和脂质组，并能同时减少多种AD病理。这些发现强调了APOE对AD病理贡献的动态和可逆性质，表明靶向APOE等位基因替换，特别是在星形胶质细胞中，可能为同时修饰多条AD相关通路提供有前景的治疗途径。

值得注意的是，虽然将E4风险等位基因完全"纠正"为神经保护性E2等位基因原则上可以同时改善大脑多方面的功能并大大降低AD风险，但这种方法并非没有风险。估计5-10%的E2/E2个体会出现III型高脂蛋白血症(HLP-III)，且E2携带与黑色素瘤、年龄相关性黄斑变性甚至某些神经系统疾病(如创伤后应激障碍和进行性核上性麻痹)的较高风险相关。事实上，APOE4s2^G小鼠的外周表型分析显示，体内E4向E2转换使动物转向HLP-III样血浆脂质谱。

考虑到这些潜在风险，研究人员推断中枢神经系统APOE靶向可能对AD具有最大的治疗前景。令人惊讶的是，研究显示在病理发作后进行为期2个月的星形胶质细胞特异性E4向E2转换，足以在5xFAD模型中减少斑块负荷、降低胶质反应性标志物并改善联想记忆(而非空间记忆)。

这些发现为未来研究提供了重要方向：首先，E4和E2分别赋予的风险和保护程度因祖先背景而异，未来APOE靶向治疗在进行风险-效益分析时应考虑祖先背景；其次，本研究使用的5xFAD模型提供了APOE依赖性淀粉样蛋白病理变化的良好表征模型，但未来研究应考虑疾病其他方面的作用，包括tau蛋白病变；最后，Aldh1l1-CreERT2对中枢神经系统的星形胶质细胞具有高度选择性，但Aldh1l1在肝脏中也有表达，未来研究应具体剖析外周ApoE对中枢神经系统的作用。

总之，本研究利用靶向APOE等位基因替换作为有前景的治疗干预措施来减轻AD风险，并描述了一个可以重现APOE替换潜在有益或有害效应的模型。结合选择性Cre品系和其他分子生物学方法，下一代"转换"模型可以提供APOE等位基因之间的细胞特异性和时间可控编辑。利用这一框架，未来研究可以帮助确定ApoE对AD发病机制的最佳细胞特异性贡献，测试APOE操作的潜在脱靶效应，并为APOE导向的临床策略建立最佳治疗窗口。