在人体器官中，癌变基因突变在正常组织中普遍存在，这表明多种事件需要协同作用以推动肿瘤的发生，并且许多生理过程如组织分化可能在一定程度上抑制癌症的发生。WNT-β-连环蛋白信号通路在维持肝脏区域分化方面起着重要作用，而编码β-连环蛋白的CTNNB1癌基因在肝细胞癌变中也经常发生突变，导致WNT信号通路异常激活，从而促进细胞增殖。本文研究了在肝肿瘤发生过程中，WNT驱动的增殖与分化之间的对抗关系，发现β-连环蛋白突变与外源性MYC表达共同作用，驱动了具有增殖特性的翻译组。当肝细胞分化为极端的zone 3命运时，这种增殖性翻译组被抑制。此外，一种GLUL和Lgr5阳性的perivenous亚群在zone 3中对WNT诱导的和MYC诱导的肿瘤发生具有抵抗力。然而，当CTNNB1和MYC突变在肝脏小叶中偶发激活时，一部分突变肝细胞会表现出增殖性和肿瘤形成性。这些早期病变的特点是WNT通路激活减少，而MAPK信号通路增强，这会抑制zone 3分化。这些增殖性病变还依赖于IGFBP2–mTOR–cyclin D1信号通路，其中抑制IGFBP2或mTOR都会显著减少增殖和肿瘤发生。因此，我们提出，zonal身份决定了肝细胞对WNT驱动的肿瘤发生的敏感性，而逃脱WNT诱导的分化是肝癌发生的关键因素。
在正常稳态下，大多数肝细胞处于静止状态，而WNT通路活性的梯度从中央静脉到门静脉结节逐渐降低，这构成了肝脏分化的调控机制。这种现象表明，肝细胞根据其在小叶中的位置执行不同的代谢功能。因此，肝脏小叶可以划分为三个区域：zone 1（门静脉附近）、zone 2（中间）和zone 3（中央静脉附近）。这种配置限制了核β-连环蛋白的活性仅限于zone 3中的肝细胞，从而驱动它们的成熟并使WNT靶基因的表达区域化。相比之下，在再生和肝细胞癌（HCC）过程中，WNT通路的活性会驱动肝细胞增殖。然而，WNT通路的激活在HCC中往往不是通过APC截断或RNF43/ZNRF3缺失等其他类型的WNT通路激活突变，但这些突变已被证明在小鼠中具有致癌性。理解CTNNB1突变如何促进肿瘤发生并改变区域化特征对于研究肝癌具有重要意义，因为先前的谱系追踪研究已经表明，在稳态肝脏中，不同区域的肝细胞在增殖方面存在差异，并且肝癌的起源细胞也具有区域特征。
为了研究常见的WNT通路突变在小鼠肝脏中的致癌潜力，我们对肝细胞上皮组织中的突变进行了分析。在小鼠肝脏中，偶发的WNT通路突变仅显示出微弱的致癌能力，需要较长的潜伏期才能形成较低的肿瘤负担。与其它组织中常见的WNT通路突变不同，通过APC缺失诱导的WNT激活并未在小鼠肝脏中显著增加内源性MYC的表达。在人类HCC中，81%的CTNNB1突变肿瘤显示出MYC拷贝数增加以及显著的MYC基因表达增强。通过将R26的LSL-MYC转基因表达在Ctnnb1的ex3/WT肝细胞中，我们观察到肿瘤形成能力的增强，同时，这种转基因的添加使许多基因程序的表达增强，这些程序也常在APC缺失的肠道中观察到。这些共享的基因集合都与mRNA翻译和蛋白质合成相关，提示在WNT驱动的癌症中需要一个致癌性翻译组。
在研究WNT驱动的肿瘤发生过程中，我们发现即使在细胞增殖阶段，β-连环蛋白的突变仍然可能受到肝脏区域化的影响。例如，在稳态肝脏中，β-连环蛋白的突变会限制到zone 3肝细胞，而当这些突变与MYC激活协同作用时，它们会驱动一个增殖性翻译组。进一步的分析表明，这种翻译组在细胞分化为zone 3命运后会被抑制。此外，我们发现，在WNT驱动的肿瘤发生中，某些特定的肝细胞亚群，如GLUL阳性的肝细胞，对肿瘤形成具有抵抗力。这些细胞在肝脏小叶的中央静脉周围形成一个单一的perivenous亚层，并未占据整个zone 3区域。通过使用多种基因工程小鼠模型诱导Cre在特定区域的表达，我们发现这些GLUL阳性肝细胞对WNT驱动的肿瘤形成具有抵抗力。具体而言，在缺乏R26的LSL-MYC转基因的情况下，CTNNB1突变的肝脏显示出在GLUL阳性肝细胞周围100微米内增加的肝细胞增殖，但并未在GLUL阳性且Lgr5阳性的中央静脉周围肝细胞中观察到这一现象。这与IGFBP2的表达开始的区域相吻合。
为了进一步确认IGFBP2、mTOR和CCND1信号轴在WNT驱动的肝癌中的作用，我们使用mTOR抑制剂雷帕霉素对这些小鼠进行治疗，并观察到显著的增殖减少。此外，我们还在IGFBP2缺失的小鼠模型中进行了CTNNB1和MYC突变的重组，并发现肝细胞增殖再次显著减少。尝试在zone 3肝细胞中过表达IGFBP2和通过AKT激活超刺激mTOR活性未能促进增殖，这表明这些因素对于致癌性生长是必要的，但不足以在终末分化的zone 3肝细胞中诱导生长。这些数据表明，与zone 2相关的IGFBP2-mTOR-CCND1信号轴在CTNNB1驱动的生长中是允许的，但WNT驱动的分化到zone 3命运会阻断这一效应。
我们还发现，在某些情况下，MAPK信号通路会对抗WNT驱动的分化，从而促进肿瘤发生。通过在Lgr5阳性中央静脉肝细胞中引入致癌性BRAF(V600E)突变，我们观察到这些肝细胞的肿瘤形成能力增强。这些BRAF(V600E)驱动的肿瘤表现出zone 1的标记CDH1，并且GLUL的表达减少。此外，通过使用AAV8.TBG.Cre介导的全肝细胞BRAF(V600E)突变，我们观察到zone 3基因转录物的表达减少，同时zone 1基因表达程序的上调。将BRAF(V600E)突变与WNT通路激活突变（如RNF43和ZNRF3缺失）结合，会显著增加器官生长并对抗区域分化，从而抑制zone 3特征的上调。通过在基因剂量依赖性方式增加BRAF(V600E)的表达，我们发现WNT诱导的zone 3分化被抑制，而增殖则主要发生在zone 3的GLUL阳性肝细胞中。降低病毒滴度以限制突变WNT通路等位基因和BRAF(V600E)的遗传重组，会导致肝脏显著的肿瘤形成，并将中位生存期缩短至50-55天。在BrRZ肿瘤模型中，使用LGK974（PORCN抑制剂）或dabrafenib（BRAF抑制剂）治疗可以显著抑制肿瘤发生。在使用LGK974治疗的BrRZ小鼠中，观察到增殖、mTOR信号和肿瘤生长的减少，同时GLUL的表达增加，CDH1和SOX9的水平降低。这些结果表明，WNT通路激活与MAPK信号的结合可以抑制zone 3分化，从而显著增强肿瘤发生。
我们还发现，在HCC中，CTNNB1的exon 3点突变是WNT通路突变的主导形式，而APC缺失在HCC中的发生率较低。通过将CTNNB1的ex3/WT替换为APC的fl/fl等位基因，我们发现APC缺失的肝细胞在诱导肿瘤发生后表现出不同的特征。例如，在day 30时，APC缺失的肝细胞显示出减少的病变形成，并且在day 60时，病变消失。此外，APC缺失的肝细胞表现出强烈的核β-连环蛋白染色，而CTNNB1突变的肝细胞则显示出不一致的核阳性。这些数据表明，HCC对CTNNB1突变比APC缺失更具可塑性。此外，我们发现，APC缺失导致的WNT通路激活水平较高，可能与肝癌发生不相容，这与HCC中APC突变的相对缺失一致。
在研究WNT通路激活和肝脏小叶区域化如何影响肝癌发生时，我们使用了一个APC的hypomorphic等位基因，该等位基因由于APC水平比野生型小鼠减少30%，从而导致更高的基础WNT通路激活。在缺乏Cre的情况下，APC的hypomorphic肝脏显示出更高的WNT和zone 3标记GLUL的表达，同时IGFBP2的表达减少。在这一背景下，我们诱导了APC的hypomorphic和R26的LSL-MYC转基因的重组，并将其与另一个非hypomorphic的APC fl/fl等位基因进行了比较。APC的hypomorphic与R26的LSL-MYC转基因的肝脏在day 4时表现出减少的增殖，这导致了在day 8时器官大小的显著减少。在缺乏Cre介导的重组的情况下，APC的hypomorphic肝脏最终会发展出肝癌，这些肿瘤表现出低WNT通路激活，不表达核CTNNB1和GLUL，但表达IGFBP2的水平变化。这些发现表明，高WNT水平的zone 3肝细胞状态并不允许WNT驱动的致癌性生长和肿瘤发生。
这些研究结果表明，WNT信号通路在肝脏中的默认功能是促进zone 3的分化，这一功能在癌变过程中被CTNNB1突变所保留。然而，要使WNT突变克隆发展为早期肿瘤，需要逆转这种分化。逆转分化依赖于WNT通路激活的减少、Yap/Taz和MAPK信号的抑制，从而允许mTOR和增殖性翻译组的激活，支持肿瘤的生长。这一机制不仅适用于肝癌，也可能适用于其他类型的癌症。例如，Axin1突变——另一种在HCC中常见的WNT通路改变——并不显著激活WNT信号，但会上调某些WNT靶基因，这些基因允许肿瘤发生。在HCC的发展过程中，不同阶段的WNT激活水平可能影响癌症的演变，这取决于癌症的发生阶段、初始细胞的来源以及额外的协同突变。在非癌症的情况下，WNT通路的超激活可以通过肝脏再生过程中产生的非正常WNT配体来解释，这些配体在稳态WNT信号梯度之外刺激生长，而不是分化。Sun等人也观察到类似的现象，他们在WNT配体刺激下观察到了zone 3以外的WNT诱导的增殖反应。
识别促进致癌性WNT驱动生长的通路和因素，有助于扩大可作为治疗靶点的范围，尤其是在历史上难以治疗的WNT通路中。这在本研究中得到了很好的体现，因为雷帕霉素对早期突变病变产生了显著的影响。通过理解携带致癌性β-连环蛋白突变的孤立肝细胞如何进展为多细胞簇，我们可以为早期肝癌的化学预防方法提供新的思路。
本研究中的方法部分详细描述了实验设计和数据分析流程。所有小鼠实验均遵循英国政府的动物福利和伦理审查委员会的批准，项目许可证为70/8646和PP3908577。小鼠在混合的个体通风笼和常规笼中饲养，环境温度保持在19–23°C，湿度保持在55±10%之间，采用12小时的光照-黑暗循环，并允许自由获取标准啮齿动物饲料和水。所有小鼠在断奶时通过商业供应商（Transnetyx）进行基因分型。为了研究老年群体的肿瘤发生，小鼠被每日监测，以体重损失和身体状况变化作为人道终点。肝脏癌症的终点通常通过显著的腹部肿胀或渐进性体重减轻来确定，而不是使用肿瘤体积测量。在老年肝癌研究中，censoring标准包括因非肝癌相关疾病（如皮肤损伤和年龄相关的淋巴瘤）或在诱导后500天内未发生肿瘤的个体。对于基因工程小鼠模型，小鼠根据基因型被分配到不同的组别，治疗组被随机分配，但为了避免将雄性小鼠单独分组，采取了相应的措施。在分组时，也努力保持性别平衡。在实验处理和样本收集时，研究人员被盲测以确保实验的客观性。在老年实验中，研究人员无法对基因型进行盲测，因为这需要知道基因型以确保实验群体的福利。组别大小是基于历史实验数据，确保有足够的统计效力来检测显著差异。
本研究使用了多种基因型、转基因和等位基因。其中包括Lgr5的CreER（参考文献39）、Gls2的CreER（参考文献13）、Glul的CreER（参考文献13）、Cyp1a2的CreER（参考文献13）、Igfbp2的CreER（参考文献40）、R26的CreER（参考文献41）、Villin的CreER（参考文献42）、Ctnnb1的ex3（参考文献43）、Apc的fl/fl（参考文献9）、Apc的fl/fl-hypomorphic（参考文献31）、Rnf43的fl/fl和Znrf3的fl/fl（参考文献44）、R26的LSL-Myc（参考文献45）、R26的LSL-tdTomato（参考文献46）、Braf的V600E（参考文献47、48）、Pten的fl/fl（参考文献49）、Yap的fl/fl（来自国际小鼠表型分析联盟的敲除小鼠项目库）和Taz的fl/fl（参考文献50）。
为了生成IGFBP2的敲除小鼠品系，我们使用了CRISPR基因编辑技术。设计了一个针对IGFPB2基因的CRISPR项目，该基因的编号为ENSMUSG00000039323/GRCm39，位置为CM000994.3。两个CRISPR引导序列被鉴定出来，它们在内含子序列周围切割exon 2（ENSMUSE00001244511），并且在体外显示出高的切割效率。这些引导序列购自Integrated DNA Technologies。为了生成电穿孔溶液，CRISPR引导序列与Cas9蛋白被结合在Optimem（Thermo Fisher Life Technologies）中。在体外受精后约7小时，将一细胞阶段的胚胎引入电穿孔溶液，并使用NEPA21电穿孔仪（Nepa Gene）进行电穿孔。次日，将二细胞胚胎转移到假孕的CD1雌性小鼠的输卵管中。随后，通过PCR使用引物F: AGACTGGGATGTGGAAGCAG和R: ACTTCTCAGTTCTCCAGGGC进行基因型鉴定，并使用Sanger测序进行验证。
小鼠在混合的C57BL/6背景中饲养。基因重组在2–4个月大的雄性和雌性小鼠中通过AAV8.TBG.Cre或他莫昔芬进行诱导。在基因工程小鼠模型中，小鼠根据基因型被分配到不同的组别。在实验分组时，采取了随机分配的方式，同时避免将雄性小鼠单独分组。分组也旨在保持性别平衡。在实验处理和样本收集时，研究人员对治疗方案和时间点进行了盲测。在老年实验中，研究人员无法对基因型进行盲测，因为这需要知道基因型以确保实验群体的福利。组别大小是基于历史实验数据，确保有足够的统计效力来检测显著差异。
在方法部分，我们详细描述了RNA原位杂交、RNA提取和测序等实验步骤。此外，还描述了数据处理和统计分析方法。通过使用生物信息学工具，如R语言中的R包进行基因集富集分析（GSEA）和基因本体（GO）过表达分析，我们对数据进行了深入的分析。这些方法的使用确保了实验结果的可靠性和可重复性。统计分析部分描述了使用的各种测试，包括单因素方差分析、Kruskal-Wallis测试、双因素方差分析、曼-惠特尼测试和柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫累积频率测试，以评估不同组别之间的差异。所有统计分析均在GraphPad Prism（v7.0.4）中进行，并遵循3Rs原则，即替代、减少和优化动物实验。通过这些方法，我们能够准确地评估实验结果的显著性，并确保数据的可信度。
总的来说，这些研究结果揭示了WNT信号通路在肝脏肿瘤发生中的复杂作用，以及不同区域肝细胞对WNT驱动的肿瘤发生的敏感性差异。这不仅有助于理解肝癌的分子机制，还为开发新的治疗策略提供了理论基础。
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