肿瘤特异性生物正交合成PROTAC和纳米颗粒增强T细胞活性的新策略

本研究针对邻近疗法（如PROTAC和T细胞免疫疗法）存在的"在靶脱瘤"毒性问题，开发了一种肿瘤选择性连接（D2L）策略。该技术通过肿瘤富集的氨基酸模拟物触发脱笼反应，实现治疗模块的原位组装，在小鼠模型中成功实现BRD4蛋白的局部降解和T细胞纳米颗粒的特异性组装，使T细胞活性提升14.8倍，显著抑制肿瘤生长且系统毒性可忽略不计。

在癌症治疗领域，如何精确引导免疫细胞或治疗分子靶向肿瘤组织而不损伤健康组织，一直是困扰研究人员的重大挑战。邻近诱导疗法作为一种新兴治疗模式，通过特异性结合改变靶蛋白命运或诱导细胞死亡，展现出巨大潜力。然而，大多数靶抗原在非肿瘤组织中也普遍存在，由此产生的"在靶脱瘤"毒性严重限制了蛋白降解靶向嵌合体和T细胞介导的免疫疗法等邻近疗法的临床应用。

以PROTAC为例，其强大的催化特性可能缩小治疗窗口，而肿瘤选择性低会导致严重的系统毒性。一些PROTAC药物在即将进入临床试验时被迫终止。同样，在接受免疫治疗的患者中，高达三分之一会出现细胞因子释放综合征，这是强大免疫效应反应的结果。基于人表皮生长因子受体2的嵌合抗原受体治疗在结直肠癌患者中曾引发致命的心肺毒性，正是因为健康组织中存在HER2的基础表达。

面对这些挑战，来自北京大学的研究团队在《Nature Biomedical Engineering》上发表了一项创新性研究，提出了一种肿瘤选择性连接策略，能够在肿瘤部位原位组装基于邻近性的治疗方法。该研究的核心在于开发了一种脱笼连接化学方法，通过肿瘤富集的氨基酸模拟物激活化学标签，触发快速、选择性的成键反应。

研究人员采用的关键技术方法包括：开发基于苯丙氨酸三氟硼酸盐触发的脱硅反应与2-甲酰基苯硼酸的选择性连接反应；建立肿瘤选择性生物正交连接系统评估蛋白降解效率；构建金纳米颗粒系统研究T细胞招募效果；并通过小鼠肿瘤模型验证治疗效果的生物安全性。

可控生物正交连接系统的建立

研究团队首先设计了脱笼连接策略，选择Phe-BF₃诱导的脱硅反应作为"脱笼部分"，2-fPBA作为"连接部分"。在筛选的五种肼衍生物中，苯肼与2-fPBA的反应不受生理肿瘤水平半胱氨酸的影响，且反应速率常数超过10⁵ M^-1s^-1。研究人员通过将苯肼的胺基用硅基-酚醚保护，显著提高了其稳定性，半衰期从8.2小时延长至超过100小时。

在活细胞实验中，靶向表皮生长因子受体的单克隆抗体西妥昔单抗经TBS保护的肼修饰后，在Phe-BF₃处理下荧光强度增加4.2倍，证明D2L策略可实现蛋白质的选择性标记。此外，在HT-1080 FAP阳性细胞与野生型细胞混合体系中，D2L策略成功实现了FAP阳性细胞的选择性成像。

原位合成PROTAC实现肿瘤特异性蛋白降解

研究团队将D2L策略应用于PROTAC的肿瘤特异性合成，设计了TBS-JQ1(+)和2-fPBA-Thd，两者在肿瘤部位条件性连接形成JQ1(+)-DAB-Thd，可募集cereblon至BRD4蛋白并诱导其降解。分子对接显示，JQ1(+)-DAB-Thd可形成稳定的三元复合物，其连接原子间距范围为3.1Å至27.4Å，覆盖了文献中常见相关化合物的范围。

在三种癌细胞系（HeLa、T47D、MV4-11）中，JQ1(+)-DAB-Thd均表现出浓度依赖的BRD4降解能力，半最大降解浓度分别为48±17 nM、1.5±0.32 nM和0.50±0.16 nM。值得注意的是，降解效率与蛋白酶体、E3连接酶DTX3L和泛素的丰度呈正相关。

肿瘤选择性蛋白降解验证

在体外实验中，Phe-BF₃可诱导HeLa细胞中BRD4免疫荧光信号特异性降低，TBS-JQ1(+)、2-fPBA-Thd和Phe-BF₃联合处理的降解效率与JQ1(+)-DAB-Thd相当。在荷瘤小鼠模型中，原位合成的PROTAC在肿瘤中浓度达到172 nM，是肝脏中的9.4倍，且超过HeLa肿瘤细胞的DC₅₀值。流式细胞术分析显示肿瘤中BRD4水平降至基线的12.7%，而脑、肺、心、肾、小肠和大肠等组织中几乎检测不到JQ1(+)-DAB-Thd，且BRD4水平保持不变。

重要的是，与传统JQ1(+)-DAB-Thd给药相比，原位合成策略显著降低了小肠毒性。组织学染色显示，JQ1(+)-DAB-Thd给药组小鼠小肠出现明显的形态学改变和潘氏细胞耗竭，而原位合成策略则避免了这些副作用。

纳米颗粒组装介导的T细胞招募

研究团队进一步将D2L策略应用于细胞间邻近性的诱导，构建了可靶向细胞的"纳米胶水"。通过将DBCO-PEG_5k-SH、NH₂-PEG_5k-SH和mPEG_5k-SH共同修饰到金纳米颗粒表面，并分别连接"2-fPBA"或"TBS"以及叠氮修饰的靶向肽，制备了具有细胞靶向能力的金纳米颗粒。

在Phe-BF₃处理下，混合金纳米颗粒（TBS&RGD@AuNPs + 2-fPBA&anti-CD3@AuNPs）发生时间依赖性组装，流体动力学尺寸从80 nm增加至350 nm。在细胞共培养体系中，条件组装的纳米颗粒平均直径达到457.7 nm，是对照组的4.82倍。透射电镜观察到一个被招募的T细胞，光学显微镜下可见肿瘤细胞周围T细胞数量显著增加。

功能实验表明，被激活的T细胞在48小时内可杀死25%的肿瘤细胞，而在10倍T细胞条件下，双特异性金纳米颗粒表现出强大的抗肿瘤活性，半最大有效浓度为272±65.3 ng mL^-1。治疗效果与整合素α_v和β₃表达水平相关，在MC38和4T1肿瘤细胞中细胞死亡率分别为49%和44%，而表达水平较低的CT26仅为18%。

体内肿瘤选择性免疫治疗

研究人员采用二元靶向策略实现体内肿瘤选择性T细胞免疫应答。金纳米颗粒通过增强渗透和滞留效应靶向肿瘤，而Phe-BF₃通过LAT-1转运体在肿瘤中积累。在B16F10荷瘤小鼠模型中，仅在Phe-BF₃处理的肿瘤组织中观察到金纳米颗粒聚集，直径达244±45.5 nm，而肝脏中纳米颗粒尺寸保持正常。

流式细胞分析显示，仅在Phe-BF₃激活下，肿瘤部位出现T细胞选择性浸润，CD3⁺和CD8⁺双阳性细胞比例达5.6±1.8%。在联合免疫治疗中，加入抗PD-1抗体可进一步提升疗效，CD3⁺和CD8⁺双阳性细胞比例增至5.64±1.72%，是单药治疗组的3.97倍。细胞因子水平也显著提升，IL-2、IFN-γ、TNF、穿孔素和颗粒酶B分别增加76%、33%、29%、73%和58%。

值得注意的是，该可控连接系统可有效克服"在靶脱瘤"毒性。在未受控的连接治疗组中，红细胞计数、血细胞比容和血小板计数分别降至42%、38%和6%，而白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞计数分别增加74.9倍、6.27倍和107.7倍，表明免疫系统功能严重紊乱。相比之下，可控连接系统的治疗组几乎未观察到上述血细胞变化，副作用可忽略不计。

研究结论与意义

该研究开发的脱笼连接策略为肿瘤选择性连接分子或细胞提供了强大工具，能够在试管、细胞和活体小鼠中实现精确的癌症治疗。该策略不仅可肿瘤选择性地生成药物或其他功能分子以克服"在靶脱瘤"毒性，还证明可控自组装是一种在局部制备新型生物材料的有效方法。

作为概念验证，金纳米颗粒的肿瘤选择性组装可模拟双特异性T细胞衔接器实现精确联合免疫治疗。这种精确的D2L策略有望应用于其他重要领域，为癌症治疗提供了一种通用化的方法，克服了邻近介导的癌症治疗的关键局限性。该研究为解决PROTAC和T细胞介导疗法在临床前和临床研究中的毒性问题提供了新思路，代表了化学生物学与药物发现交叉领域的创新突破。