突破辐射损伤屏障：新型抗辐射树脂实现大脑组织的无损X射线纳米断层成像

本研究针对X射线纳米断层成像技术在生物软组织成像中因辐射损伤导致分辨率受限的难题，通过开发一种应用于核工业与航空航天领域的抗辐射环氧树脂（TGPAP-DDM），结合低温样品台和非刚性断层重建算法，成功使小鼠脑组织耐受超过1.15×1010 Gy的辐射剂量，并实现<40 nm的各向同性分辨率，首次在X射线成像中清晰识别出突触等关键超微结构。该技术为连接组学提供了非破坏性、可扩展的高分辨率三维成像新工具。

在神经科学领域，绘制亚细胞分辨率的大脑三维结构图是理解神经环路功能的基础。目前，体积电子显微镜（volume electron microscopy）是获取组织超微结构的金标准技术，但其存在固有局限：电子穿透深度极浅，必须通过连续切片或铣削来获取三维信息，这不仅流程复杂耗时数月，还存在信息丢失和图像配准困难的风险。

相比之下，X射线具有毫米级穿透能力，理论上可实现无损三维成像。同步辐射光源能提供高亮度X射线，使纳米级分辨率成像成为可能。然而，将X射线纳米断层成像应用于生物软组织一直面临两大根本性挑战：首先是软组织固有的低对比度，其次也是更关键的，是高强度X射线在成像过程中会引发样品变形甚至分解，严重限制了可用的辐射剂量和最终分辨率。此前普遍认为，辐射损伤是生物组织高分辨率X射线成像不可逾越的障碍。

发表在《Nature Methods》上的这项研究，标题为“Nondestructive X-ray tomography of brain tissue ultrastructure”，成功突破了这一屏障。研究团队通过整合多种创新解决方案，实现了对小鼠脑组织的高分辨率、无损X射线三维成像，并证实了其识别突触等关键连接组学特征的能力。

研究团队采用了多项关键技术：1）使用OMNY低温纳米断层样品台，将样品冷却至<95 K，以减少电离辐射引起的结构变化；2）应用针对辐射诱导变形补偿的非刚性断层重建算法；3）最关键的是，筛选并采用了一种源于核工业和航空航天领域的抗辐射环氧树脂——三缩水甘油基对氨基苯酚（triglycidyl para-aminophenol, TGPAP）与4,4'-二氨基二苯甲烷（4,4'-diaminodiphenyl methane, DDM）固化剂组成的嵌入介质（树脂E），替代传统的电子显微镜用环氧树脂（如EPON812）。小鼠脑组织样本（嗅球、海马、体感皮层）经（ferrocyanide）reduced osmium-thiocarbohydrazide-osmium (ROTO)重金属染色后，嵌入不同树脂中进行对比。成像主要在瑞士光源（SLS）的cSAXS光束线完成，使用6.2 keV单色光，通过ptychographic X-ray computed tomography (PXCT)技术采集数据。

X射线ptychography解析脑组织超微结构

PXCT通过扫描样品穿过一个受限的相干X射线束（直径数微米）并测量远场衍射图样（图1a）来工作。通过迭代重建算法，这些衍射图用于生成与样品投影电子密度成正比的相位图像（图1b）。为进行断层扫描，在0°至180°的多个样品旋转角度上采集投影，然后重建三维样本体积（图1c）。

一种用于增强抗辐射性的“坚韧”环氧树脂

辐射应力测试表明，传统硬EPON树脂（树脂B）嵌入的样品在ESRF的BM05光束线接受平均能量25 keV的宽谱X射线照射后，很快出现质量损失并完全分解（图2b）。而TGPAP-DDM树脂（树脂E）由于每个分子含有三个环氧基团，固化时交联度更高，且单体与固化剂中的苯环结构进一步增强了抗辐射性。即使长时间暴露，TGPAP嵌入的样品也未显示质量损失或细胞结构受损的迹象（图2d）。

剂量依赖的分辨率

研究系统评估了分辨率与辐射剂量的关系。PXCT分辨率与所用剂量的四次方成正比。在低剂量（1.8×10⁷ Gy）下，分辨率约为84 nm（图3a）；剂量增至3.8×10⁸ Gy时，分辨率提升至约70 nm（图3b）。然而，更高剂量下，样品会发生变形。通过应用非刚性断层重建方法，估计并补偿了投影之间的变形，在剂量为3.8×10⁸ Gy时，分辨率显著提升至49.7 nm（图3b,d），更接近理论预测。使用抗辐射树脂TGPAP，可将剂量进一步提高至2.7×10⁹ Gy，并获得38 nm的各向同性分辨率（图3c,e），足以分辨亚细胞特征。

X射线ptychography可检测到的亚细胞特征

在不同脑区（嗅球外丛状层、小球层、海马辐射层、体感皮层2-3层）的成像中，PXCT能够可视化神经突、线粒体、髓鞘和细胞核等亚细胞结构（图4），证明了该技术的普适性。

用X射线检测突触

突触检测是连接组学的关键。在剂量为3.8×10⁸ Gy的PXCT图像中，出现了类似突触的结构（图5a,e）。利用PXCT非破坏性的特点，研究人员对同一标本进行了聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）成像作为金标准验证。FIB-SEM结果显示，即使接受了约4×10⁸ Gy的X射线剂量，组织超微结构（如膜结构、线粒体、内质网、囊泡）仍保持完整（图5b）。将FIB-SEM与PXCT数据集对齐后，定量评估了突触识别的可靠性。在随机选取的1 μm³子体积中，以FIB-SEM为金标准，PXCT识别突触存在的召回率（recall）为65%，精确度（precision）为80%（图5d）。对于更高剂量（2.5×10⁹ Gy）的TGPAP嵌入样品，突触识别能力有进一步提升的趋势（图5i）。

组织超微结构可承受2.5×10⁹ Gy的X射线剂量

PXCT后的FIB-SEM分析证实，TGPAP对组织的渗透性良好，超微结构保存完整，即使总吸收剂量超过1.15×10¹⁰ Gy也是如此（图6a,b）。细胞外空间占比为16±2%，与其他样品制备方案相当。研究还展示了在PXCT数据中手动分割囊泡簇和突触密度的可行性（图6c）。使用针对EM数据开发的流程进行自动分割显示，高对比度特征（如线粒体）和许多神经突的分割结果与FIB-SEM数据集一致。

本研究证明了同步辐射X射线纳米断层成像具有以足够分辨率可靠检测突触等关键超微结构特征的潜力。通过结合抗辐射嵌入材料（TGPAP-DDM）、重金属染色、低温成像和非刚性重建方法，成功克服了辐射损伤这一根本性限制，使生物组织能够承受超过1.15×10¹⁰ Gy的辐射剂量。分辨率的提升主要得益于抗辐射树脂的应用，其理论上的高交联度和苯环结构提供了卓越的机械强度和辐射耐受性。虽然辐射仍可能导致局部组织改变和全局变形，但超微结构本身（如膜和蛋白质簇）基本未受影响，非刚性重建算法有效补偿了这些变形带来的模糊效应。

这项工作为连接组学和更广泛的组织生命科学研究解锁了一种本质上是非破坏性、可扩展且高度可靠的新技术。随着第四代高亮度X射线光源的出现，X射线断层扫描技术有望成为获取超微结构分辨率组织图像的重要工具。未来的方向包括进一步优化重建算法、探索更适合X射线成像的对比度增强方法（如散射强但吸收弱的材料）、以及将成像体积扩大到毫米级（例如通过层析成像几何）。相关体积电子显微镜不仅能提供高分辨率的地面实况数据，辅助下游数据处理和分割，还将有助于推动对X射线数据的进一步注释和理解。