DNA聚合酶δ亚基3（POLD3）作为新型组蛋白伴侣与MCM2互作调控哺乳动物细胞亲本组蛋白对称遗传的机制研究

本研究针对哺乳动物细胞DNA复制过程中亲本组蛋白对称分配机制不清的问题，通过TurboID邻近标记技术系统解析MCM2和POLE3/POLE4相互作用组，首次发现DNA聚合酶δ亚基3（POLD3）与MCM2和组蛋白（H3-H4）2四聚体形成三元复合物，证实POLD3作为新型组蛋白伴侣调控亲本组蛋白向滞后链的转移，为表观遗传继承机制提供了新见解。

在细胞分裂过程中，遗传信息不仅通过DNA序列传递，还通过表观遗传标记得以继承。其中，亲本组蛋白及其修饰的对称分配是维持细胞身份的关键环节。近年来研究发现，在哺乳动物细胞中，亲本组蛋白在DNA复制叉处近乎对称地分配到前导链和滞后链，但这一精密过程的分子机制仍存在大量未知。尤其是与酵母中已明确的Mcm2-Ctf4-Pola1信号轴相比，哺乳动物细胞中相应的调控网络尚未完全阐明。

为了解决这一重要科学问题，来自中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所的甘海云研究员和李楠研究员团队在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》上发表了最新研究成果。研究人员聚焦于两个已知的组蛋白伴侣——MCM2（微染色体维持蛋白复合体组分2）和POLE3/POLE4（DNA聚合酶ε亚基3/4），试图揭示它们在哺乳动物细胞中调控亲本组蛋白分配的新机制。

研究团队采用了多种前沿技术手段开展系统性研究。主要包括TurboID邻近标记技术构建蛋白质相互作用网络、eSPAN（新生DNA蛋白质富集测序）技术分析组蛋白链偏向性、体外蛋白质互作验证（如免疫共沉淀、GST pull-down、生物层干涉技术）以及功能缺失实验（如siRNA敲低）等。

研究首先通过TurboID邻近标记技术构建了MCM2和POLE3/POLE4的相互作用组。研究人员在小鼠NIH3T3细胞中表达了MCM2、POLE3和POLE4与TurboID的融合蛋白，通过生物素标记和质谱分析，成功鉴定了640个MCM2相互作用蛋白和648个POLE3/POLE4相互作用蛋白。生物信息学分析显示，这些相互作用蛋白与DNA复制、染色质组织和细胞周期等过程密切相关，验证了数据的可靠性。

进一步，研究人员通过比较野生型MCM2和其组蛋白结合突变体MCM2-2A的相互作用组差异，筛选出245个在MCM2-2A中低富集的蛋白，其中包括DNA聚合酶δ亚基3（POLD3）。值得注意的是，POLD3是差异最显著的蛋白之一，且与MCM2和POLA1（DNA聚合酶α亚基1）存在相互作用。

为验证POLD3在亲本组蛋白分配中的功能，研究团队在小鼠E14TG2a胚胎干细胞中敲低POLD3，并利用eSPAN技术分析组蛋白链偏向性。结果显示，在POLD3敲低细胞中，亲本组蛋白（通过H4K20me2和H3K36me3标记）表现出强烈的前导链偏向，而新合成组蛋白（通过H4K12ac标记）则呈现滞后链偏向。这一发现表明POLD3确实参与调控亲本组蛋白向滞后链的分配。

接下来，研究人员深入探讨了POLD3作为组蛋白伴侣的分子机制。通过免疫共沉淀实验，他们发现POLD3与组蛋白H3直接相互作用，且这一相互作用主要依赖于POLD3的C端区域（氨基酸145-466），而非其N端聚合酶δ复合体结合区域。体外实验进一步证实POLD3能够直接与组蛋白（H3-H4）₂四聚体结合，但不能与H2A-H2B二聚体结合，表明POLD3特异性识别（H3-H4）₂四聚体。

更为重要的是，研究团队发现了MCM2、POLD3和（H3-H4）₂四聚体之间存在三元相互作用。通过体外pull-down和生物层干涉实验，他们证实这三种分子能够形成稳定的蛋白质复合物。结合常数测定显示，POLD3与（H3-H4）₂四聚体的亲和力（K_D = 2.70 nM）强于MCM2与POLD3之间的亲和力（K_D = 10.20 nM），提示组蛋白可能在MCM2和POLD3之间传递。

有趣的是，当在MCM2-2A突变细胞（组蛋白结合缺陷）中过表达POLD3时，POLD3与组蛋白H3的结合显著减少，表明MCM2的组蛋白结合能力影响了POLD3与组蛋白的相互作用。这一发现支持了组蛋白从MCM2向POLD3传递的可能性。

与酵母中的Ctf4（哺乳动物WDHD1的同源物）不同，研究人员发现敲低WDHD1并不影响小鼠胚胎干细胞中亲本组蛋白的分布模式，提示哺乳动物细胞中亲本组蛋白分配机制与酵母存在差异。

研究结论与讨论部分强调，该研究不仅提供了参与MCM2或POLE3/POLE4信号通路的候选蛋白库，还确立了POLD3作为新型组蛋白伴侣在哺乳动物细胞亲本组蛋白对称分配中的关键作用。这一发现填补了哺乳动物细胞亲本组蛋白转移机制的知识空白，为理解表观遗传继承的分子基础提供了新视角。

研究的创新性在于首次将POLD3与组蛋白伴侣功能联系起来，揭示了MCM2-POLD3-（H3-H4）₂四聚体复合物在DNA复制过程中的重要作用。考虑到亲本组蛋白的正确继承对维持细胞命运和防止肿瘤发生至关重要，该研究对理解发育和疾病机制也具有重要启示。

尽管该研究取得了重要突破，但仍存在一些局限性，如使用过表达系统而非CRISPR敲入细胞进行TurboID实验，尚未鉴定POLD3上与组蛋白和MCM2互作的具体位点等。未来研究需要进一步阐明组蛋白从MCM2向POLD3传递的详细机制，并探索POLD3的组蛋白伴侣功能在哺乳动物发育和细胞分化中的影响。

总之，这项研究深化了我们对DNA复制过程中表观遗传信息继承机制的理解，为相关疾病的研究和治疗提供了新的分子靶点和理论依据。