剖析子宫内膜癌对标准化疗及靶向治疗反应的复杂性：患者来源类器官与癌相关成纤维细胞的综合研究

本研究针对子宫内膜癌(EC)发病率上升、异质性高且治疗响应预测工具缺乏的临床挑战，成功构建了患者来源类器官(PDOs)平台。研究发现EC-PDOs在组织学、基因组和转录组层面高度模拟原发肿瘤，且对卡铂+紫杉醇标准化疗及PI3K/AKT/mTOR通路靶向药物（如Gedatolisib、Alpelisib）的响应与患者临床结局一致。尤为重要的是，研究首次分离并表征了匹配的癌相关成纤维细胞(CAFs)，发现其对化疗耐药并可通过衰老相关分泌表型(SASP)促进肿瘤微环境(TME)重塑。该平台为EC个体化治疗筛选及TME机制研究提供了创新工具。

在全球范围内，子宫内膜癌(Endometrial Cancer, EC)已攀升至女性常见恶性肿瘤的第六位，2020年新发病例高达41.7万。过去三十年间，其总体发病率激增132%，这与肥胖、人口老龄化等风险因素的流行密切相关。更令人担忧的是，发病年龄呈现年轻化趋势，40岁以下患者的比例翻倍，占美国所有低级别EC诊断的4.2%，其中约70%在诊断时未生育，对社会和个体生育能力造成了巨大影响。EC传统上被分为两种临床病理亚型：预后较好、雌激素依赖的I型（常伴有PTEN、KRAS、CTNNB1和PIK3CA基因改变）和侵袭性强、预后差的II型（以TP53突变和雌激素受体缺失为特征）。近年来，癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)基于基因组改变提出了新的EC分子分型，将其分为四组：POLE超突变型、微卫星不稳定高突变型、拷贝数低型和拷贝数高型，这为预后预测和治疗选择提供了更精确的指引。然而，EC的一线治疗仍以手术为主，辅助治疗主要依赖放疗和卡铂联合紫杉醇的标准化疗。面对EC的异质性和部分患者（如低分化腺癌和癌肉瘤）对标准化疗响应不佳的困境，开发能够忠实反映患者肿瘤特性并用于快速药敏测试的临床前模型变得至关重要。

患者来源类器官(Patient-Derived Organoids, PDOs)是一种三维(3D)培养体系，能够自我组织并长期维持原代肿瘤的组织病理学和表型特征。近年来，PDOs系统在分析包括EC在内的多种肿瘤的异质性、评估放化疗、靶向及免疫治疗反应方面展现出巨大价值。此外，肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)，特别是其中含量最丰富的癌相关成纤维细胞(Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs)，在EC的发生、发展、治疗抵抗和复发中扮演着关键角色。CAFs通过细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)重塑、上皮-间质转化(Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT)等过程影响肿瘤行为，但其在EC中的具体作用及对治疗响应的影响尚需深入探索。

本研究旨在建立一个源自原发性子宫内膜癌的3D培养系统，该系统能在组织病理学和分子水平上高度模拟其匹配的原发肿瘤，并研究类器官与患者匹配的CAFs之间的相互作用，重点关注癌症增殖和药物化学敏感性。

本研究的关键技术方法包括：从IRCCS Regina Elena国家癌症研究所接受治疗的EC患者新鲜肿瘤组织中成功建立并长期培养PDOs（成功率80%）；从PDOs培养物中分离、培养并通过流式细胞术、免疫荧光等技术鉴定匹配的CAFs；对匹配的组织、PDOs和CAFs进行全外显子测序(Whole-Exome Sequencing, WES)和RNA测序(RNA-seq)分析基因组和转录组一致性；利用自动化液体处理工作站和高内涵成像系统（Opera Phenix Plus）对PDOs和CAFs进行标准化疗（卡铂、紫杉醇）及针对特定基因突变（如PIK3CA, KRAS, PLK1）的靶向药物高通量筛选和活力检测（ATPlite发光法、活死细胞染色）；并通过衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、细胞因子检测等分析CAFs对化疗的反应。

研究结果

EC-PDOs的建立与组织学验证

研究人员成功从连续入组的EC患者肿瘤组织中建立了PDOs平台。组织学(H&E)染色和免疫组织化学(IHC)分析显示，PDOs很好地保留了匹配原发肿瘤的组织结构和细胞架构，以及雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、细胞角蛋白CKAE1/AE3、TP53等关键标志物的表达。有趣的是，PDOs的形态（囊状或实性）与其来源肿瘤的分化程度相关，例如EC_6T和EC_10T（分化良好的子宫内膜腺癌，G2）来源的PDOs呈囊状结构，而EC_7T（低分化子宫内膜腺癌，G3）来源的PDOs则呈实性结构。这表明EC-PDOs在组织学上与匹配的EC组织具有显著的相似性。

EC-PDOs与匹配EC组织具有基因组一致性

全外显子测序(WES)分析表明，PDOs保留了原发肿瘤中存在的大部分体细胞突变。对TCGA数据库中EC最常见的41个突变基因的分析显示，原发肿瘤中的大多数突变在PDOs中得以保留。变异等位基因频率(Variant Allele Frequency, VAF)分析（通过NGS和数字PCR验证）显示，原发肿瘤与对应类器官在主要突变基因（如PIK3CA, KRAS, TP53）的VAF上高度相关。拷贝数变异(Copy Number Alteration, CNA)和杂合性缺失(Loss of Heterozygosity, LOH)分析进一步证实，PDOs能够忠实地再现原始肿瘤的基因组异质性。

EC-PDOs再现原代匹配EC患者的基因表达谱

RNA测序(RNA-seq)和单样本基因集富集分析(single-sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA)显示，PDOs与其匹配组织在癌症相关通路（如PI3K/AKT/MTOR信号、MYC靶点等）的基因表达上高度相似。虽然与免疫和血管成分相关的基因在PDOs中略有下调，但与上皮-间质转化(EMT)和基质细胞（包括成纤维细胞）相关的基因表达则非常相似。基于29个功能基因集的ssGSEA将样本分为四种TME亚型（免疫富集纤维化IE/F、免疫富集IE、纤维化F、耗竭D），80%的PDOs样本保持了与其对应原发组织相同的亚型。皮尔逊相关性分析进一步证实了PDOs与匹配原发肿瘤在基因表达上的高度相似性。

EC-PDOs对EC患者标准疗法的反应

利用自动化平台和高内涵成像系统，研究人员评估了PDOs对卡铂、紫杉醇及其联合用药的敏感性。大多数PDOs（如源自G2肿瘤的1T、6T、10T PDOs）对联合化疗表现出高敏感性，而源自侵袭性亚型（如G3的7T PDOs和癌肉瘤9T PDOs）的PDOs则反应微弱。这种差异与这些亚型患者预后较差、对标准化疗反应不佳的临床观察一致。通过分析类器官活力、形态参数（面积、圆度等）的机器学习方法得到的结果与ATPlite活力测定结果一致，证实了EC-PDOs平台在测试标准化疗疗效方面的价值。

EC-PDOs作为靶向治疗疗效测试工具

基于WES结果，研究对携带特定基因突变的PDOs进行了靶向药物测试。例如，携带PIK3CA p.C420R和PLK1 p.R364Q突变的6T_PDO对PI3K/mTOR双抑制剂Gedatolisib和PLK1抑制剂Volasertib敏感；携带PIK3CA p.E542Q和AKT3 p.E232K突变的7T_PDO对Alpelisib、Gedatolisib和AKT抑制剂Ipatasertib敏感；而携带PIK3CA p.R88Q/p.R108H和ERBB2 p.L755S突变的10T_PDO对Alpelisib和Gedatolisib敏感，但对针对ERBB2的抗体偶联药物Trastuzumab deruxtecan不敏感，这与ERBB2 p.L755S突变已知的耐药性一致。靶向治疗在降低类器官活力和大小方面往往比标准化疗更有效，且半数抑制浓度(IC₅₀)与药物血浆浓度有可比性。这表明EC-PDOs平台可用于指导针对特定基因改变的个性化精准治疗。

EC-PDOs中癌相关成纤维细胞(CAFs)的表征

在类器官培养过程中，研究人员分离并鉴定了具有纺锤形形态的匹配CAFs。流式细胞术和免疫荧光证实这些细胞表达CAFs标志物（α平滑肌肌动蛋白αSMA、成纤维细胞活化蛋白Fibroblast Activation Protein, FAP、波形蛋白Vimentin），而不表达上皮细胞（上皮细胞粘附分子EpCAM）或内皮/免疫细胞（CD31, CD45）标志物。基因组学分析显示，CAFs的基因组改变、LOH状态和肿瘤突变负荷(Tumor Mutational Burden, TMB)均显著低于匹配的肿瘤组织和PDOs。转录组学分析表明，CAFs与正常的子宫内膜基质成纤维细胞明显不同，其代谢、免疫反应和癌症相关通路显著富集，CAF和EMT特征基因表达上调。

EC-CAFs对标准化疗的反应比匹配的EC-PDOs差

与PDOs相比，分离的CAFs对卡铂+紫杉醇联合化疗的敏感性较差，细胞活力下降不明显。经化疗处理后，CAFs发生显著的形态学变化（面积减小、圆度增加），并呈现剂量依赖性的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性升高、p21/p16/p53核表达增加以及白细胞介素-6(IL-6)等衰老相关分泌表型(Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP)因子分泌增加。这表明EC中的CAFs对化疗具有抵抗性，并可能通过发生衰老和分泌SASP因子来重塑TME，从而促进耐药和疾病进展。

PDOs预测接受辅助化疗的EC患者的临床结局

对5名高危EC患者的回顾性分析显示，其PDOs在体外对标准化疗的反应（良好或不良）与患者实际的临床结局（无进展生存期PFS、总生存期OS）高度一致。例如，对化疗反应良好且无复发的患者（Pt#2, Pt#8），其PDOs活力显著降低；而对化疗反应差、早期复发并死亡的患者（Pt#9），其PDOs则表现出耐药性。此外，原发肿瘤中CAFs标志物αSMA的高表达与EpCAM的低表达，与PDOs的体外耐药性和患者的不良治疗反应相关。这表明EC-PDOs有潜力作为预测EC患者化疗敏感性和临床预后的工具。

研究结论与意义

本研究成功地建立了一个能够高度模拟子宫内膜癌原发肿瘤组织学、基因组和转录组特征的PDOs平台。该平台不仅能够预测患者对标准化疗的反应，还能有效评估针对特定基因突变（如PIK3CA、AKT3）的靶向药物的疗效，为EC的个体化治疗选择提供了强大的临床前工具。研究首次在EC模型中系统分离和表征了匹配的CAFs，并揭示其对标准化疗的抵抗性和化疗诱导的衰老表型，这为理解TME在EC治疗抵抗中的作用提供了新的机制见解。CAFs通过SASP影响TME可能是导致耐药和疾病进展的关键因素之一。尽管需要更多前瞻性多中心数据来验证，但本研究证实，利用EC-PDOs等3D临床前模型进行药物敏感性测试，有望成为识别EC患者疾病进展风险、指导精准肿瘤治疗的预测工具。对原发肿瘤以及在不同抗癌治疗选择压力下进化的匹配耐药癌组织的PDOs进行生物样本库保藏，将为克服耐药性机制研究和制定创新治疗方案提供独特且宝贵的资源。