平行停流单分子技术：多维度解析生物大分子动态机制的通用平台

本研究针对单分子荧光技术通量低、实验变异性大的瓶颈，开发了平行快速交换单分子荧光/FRET技术，实现了多生物系统在稳态与预稳态条件下的同步观测。该技术通过微流控芯片阵列与DNA编码定位，成功揭示了β- arrestin1激活的构象时序、抗生素对mRNA解码保真度的影响及核糖体异质性对药物敏感性的调控机制，为高精度定量生物分子功能研究提供了可扩展的通用解决方案。

在生命科学领域，单分子荧光成像技术犹如一台高精度显微镜，让科学家能够实时观测单个生物分子的构象变化与相互作用，揭示了许多传统 ensemble（群体）测量方法无法捕捉的动态细节。然而，这门强大的技术一直面临着一个严峻挑战：实验通量低下。研究人员通常只能逐个样品进行检测，不仅耗时耗力，更棘手的是，实验条件难以完全重复，微小的环境波动就可能导致数据对比失真，使得在关键生物学问题中——例如野生型与突变体蛋白的细微功能差异，或药物作用下生物大分子的瞬时响应——难以得出确凿结论。

为了突破这一瓶颈，来自圣犹达儿童研究医院和哥伦比亚大学的研究团队在《Nature Methods》上发表了他们的最新成果——平行快速交换单分子荧光及FRET技术。这项技术巧妙地融合了微流控芯片、DNA编码定位和高速溶液交换系统，首次实现了对多达四个（通过光谱复用可达八个）不同生物样本的同步、高通量单分子观测，为在严格一致的实验条件下进行精准比较研究提供了革命性工具。

研究人员为开展这项研究，主要运用了以下几项关键技术：首先，搭建了基于棱镜的全内反射荧光显微镜平台，并结合平顶光场照明技术，确保了成像视野内光照强度的均一性；其次，设计并制作了定制化的微流控芯片，其表面通过微接触打印技术形成了包含多种正交DNA锚定序列的微阵列，从而能够通过DNA杂交特异性固定不同的生物分子；再者，引入了DNA链置换技术，能够可逆地固定和释放生物分子，实现了芯片的可重复使用和分子密度的精确调控；最后，整合了计算机控制的流体控制系统，实现了毫秒级的快速溶液交换，从而能够对生物分子进行类似于停流技术的预稳态动力学研究。

用于单分子成像的微流控芯片与微阵列

研究团队首先构建了包含十个独立腔室的微流控芯片，每个腔室表面通过微接触打印技术制作了60个相同的2x2微阵列。每个微阵列点位上固定了不同的DNA锚定序列，从而能够通过杂交特异性捕获带有互补“系链”DNA的生物分子。

这种设计使得在一个视野内可同时观测四种不同的样本。此外，通过DNA链置换技术，可以精确控制表面分子密度甚至完全清除分子，为实验的重复性和可靠性提供了保障。

微阵列结合的特异性与可调性

为了验证该平台的特异性，研究人员使用了四种具有不同FRET特征的DNA双链体进行测试。结果显示，每个微阵列点位上的分子均表现出狭窄且特异的FRET效率分布，结合特异性高达97.5% ± 1.8%。

这表明该技术能够实现高度特异性的样本并行检测。

荧光团性能的并行化定量

利用PRE-smF技术，研究人员在完全相同的条件下，并行比较了八种常用荧光团（包括LD系列和ATTO系列）的光物理性能。结果表明，自愈合LD555和LD655荧光团在氧合和脱氧条件下均表现出更优的信噪比和光子产量，而ATTO荧光团在脱氧环境下性能显著下降。这种并行比较方法不仅将实验通量提高了八倍，而且消除了批次间差异，保证了数据的可靠性和可重复性。

计算机控制的停流PRE-smF(RET)研究

通过集成计算机控制的流体系统，研究团队实现了毫秒级（最快60毫秒）的快速溶液交换。

他们以亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸结合蛋白为例，成功观测到了其在与配体结合和解离过程中构象在开放（低FRET）和闭合（高FRET）状态之间的快速、可逆切换，验证了该系统进行预稳态动力学研究的可行性。

β- arrestin1激活的并行化多视角成像

作为生物学应用的重要展示，研究人员利用PRE-smFRET技术，从四个不同的结构视角（C端尾巴释放、指环构象变化和C端结构域旋转）同步监测了β- arrestin1在结合V2Rpp磷酸肽过程中的激活动力学。稳态滴定实验显示，不同传感器对V2Rpp的表观亲和力存在差异，其中指环传感器的亲和力最高，而C端结构域旋转传感器的亲和力最低。预稳态动力学分析进一步表明，V2Rpp的结合是一个远低于扩散极限的多步过程，并且不同构象事件的速率常数存在显著差别，提示β- arrestin1的激活可能遵循一定的时序。

突变体验证表明，这些差异并非由标记位点引入的扰动所导致，而是反映了内在的激活机制。

mRNA解码的并行化测量

研究还将该技术应用于更复杂的细菌核糖体系统，通过mRNA上的特异“系链”序列，在单次实验中并行监测了核糖体对两种同义密码子和两种近义密码子的解码保真度。结果清晰展示了同义密码子高效解码和近义密码子高效淘汰的过程。在加入错误诱导抗生素链霉素后，PRE-smFRET不仅证实了链霉素促进近义密码子误读的已知现象，还意外地发现链霉素普遍降低了三元复合物与核糖体的初始结合速率，但同时加快了初始选择和校对过程的速率。

PRE-smF(RET)揭示携带rRNA序列变异的核糖体的差异抗生素敏感性

最后，研究团队利用PRE-smFRET技术，直接比较了由大肠杆菌内源性rrnB和rrnH操纵子编码的两种核糖体亚型对四环素类抗生素的敏感性。结果表明，携带rrnH变异的核糖体对四环素表现出相对耐药性，而对氧四环素则更为敏感。

这一发现从单分子水平直接证实了核糖体异质性在调控抗生素敏感性中的功能意义，为理解细菌耐药性提供了新视角。

综上所述，本研究开发的PRE-smF(RET)技术成功解决了单分子研究领域长期存在的通量低和实验变异性大的难题。通过将微流控芯片阵列、DNA编码定位和高速溶液交换技术有机结合，该平台能够在严格一致的条件下，对多种生物系统进行并行的稳态和预稳态单分子观测。研究团队不仅利用该技术完成了从荧光团性能比较到复杂蛋白质构象动力学、再到核糖体功能与异质性研究等一系列跨尺度、多领域的应用示范，更重要的是揭示了β- arrestin1激活的可能时序、链霉素影响解码的新机制以及核糖体异质性对药物敏感性的直接调控等新的生物学见解。这项技术具有高度的通用性和可扩展性，通过增加微阵列密度和复用策略，有望进一步大幅提升通量。它的出现标志着单分子生物物理学进入了一个高通量、高重现性的新阶段，为在未来进行大规模比较研究、甚至高通量筛选打开了大门，必将极大地推动对生命过程分子机制的精确定量理解。