马尔堡病毒糖蛋白的整体结构与功能
马尔堡病毒（MBV）是丝状病毒科（Filoviridae）的一员，可引起严重出血热，其平均病死率（73%）显著高于埃博拉病毒（EBOV，44%）。病毒侵入宿主细胞是其感染性和致病性的关键决定因素，而这一过程由病毒表面的糖蛋白（GP）介导。与已被广泛研究的EBOV GP相比，MBV GP的结构与功能特征此前知之甚少。本研究首次比较了MBV GP与EBOV GP介导病毒侵入的效率。通过使用携带野生型全长GP的假病毒，并采用一种新颖的双重归一化策略以精确匹配不同GP的表达水平，研究发现无论是RAVV还是Musoke株的MBV GP，在感染人肝癌细胞（Huh7）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人单核细胞来源的巨噬细胞（THP-1）时，其侵入效率均远超EBOV GP，在某些细胞中高出300倍以上。这首次证明MBV GP是一种高效的病毒侵入介质，可能部分解释了MBV感染的高致死率。
为了从结构层面探究其高效侵入的机制，研究人员利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了RAVV MBV GP胞外域的三种状态结构：1）去除聚糖帽和粘蛋白样结构域（MLD）的切割形式GPcl；2）GPcl与其内体受体NPC1的C结构域（NPC1-C）的复合物；3）仅去除MLD而保留聚糖帽的GP-ΔM与一种中和纳米抗体Nanosota-MB1的复合物。这些结构代表了MBV GP单独存在以及与受体、抗体结合的首批高分辨率结构。
MBV GP的聚糖帽：部分灵活的免疫屏蔽
在未结合配体的RAVV GPcl结构中，一个出人意料的发现是，尽管聚糖帽已被蛋白酶完全切除，但仍有一个由9个残基构成的环（loop 207）结合在受体结合位点（RBS）上。这与之前基于抗体复合物结构认为MBV GP聚糖帽完全灵活的观点不同。比较研究发现，EBOV GP的对应环（loop 221）以反平行β-折叠形式回折，而RAVV的loop 207则横跨RBS，但两者都占据了一个保守的疏水口袋。这表明MBV GP的聚糖帽在游离状态下其灵活性受到与RBS相互作用的限制。
功能上，表面等离子共振（SPR）实验证实，RAVV GP的聚糖帽发挥着调节配体接近的作用：它完全阻断了受体NPC1与GP-ΔM（保留聚糖帽）的结合，但对中和纳米抗体Nanosota-MB1的阻碍则只是部分的。Nanosota-MB1与GP-ΔM的结合解离常数（Kd）为4.77 × 10−8M，而与GPcl的结合则达到了超高的2.68 × 10−12M。这表明MBV GP进化出了一种部分灵活的聚糖帽，它在完全屏蔽受体结合的同时，只允许部分高亲和力的抗体接近，从而在免疫逃避和侵入效率之间取得平衡。
MBV GP与NPC1的相互作用：独特的结合模式与更高亲和力
RAVV GPcl与NPC1-C的复合物结构揭示了二者相互作用的显著特点。与已知的EBOV GPcl-NPC1-C复合物相比，NPC1-C在结合RAVV GPcl时发生了39.4°的旋转。深入分析发现，NPC1-C通过三个环（loop 1, loop 2和一个额外的loop 3）与RAVV的RBS结合，而结合EBOV GPcl时只使用两个环（loop 1和loop 2）。这个额外的loop 3（包含残基Asp436和Ile437）为NPC1-C的结合提供了额外的锚点，稳定了其旋转后的取向。
在分子层面，RAVV与EBOV的RBS存在关键的氨基酸差异。例如，EBOV RBS中由二硫键连接的Cys121和Cys147，在RAVV中被替换为Leu105和His131。这种替换使得RAVV的RBS更靠近NPC1-C的loop 3，从而建立了新的相互作用。SPR亲和力测定证实，RAVV GPcl与NPC1-C的结合强度（Kd= 3.94 × 10−7M）比EBOV GPcl（Kd= 4.34 × 10−6M）高出约11倍。点突变实验进一步验证了NPC1-C上关键残基（如His418, Ile419, Asp436, Ile437）在介导与RAVV特异性高亲和力结合中的重要作用。
此外，RAVV GP RBS口袋开口处的构象也发生了重塑。三个区域（残基62-65, 124-128, 130-133）相对于EBOV GPcl发生了显著的向外或向内移动，这共同塑造了一个能接纳NPC1-C以独特、高亲和力方式结合的界面。
NPC1触发的GP构象变化：促进膜融合的关键步骤
将结合NPC1-C的RAVV GPcl结构与游离状态对齐，发现NPC1的结合诱导了GP1亚基发生显著的构象变化。多个结构元件向外移动，远离三聚体的中心。其后果是，三个原体之间的距离增大，它们之间的埋藏界面从1587 Å2减少到1402 Å2。这种原体间包装的松动被认为降低了从融合前状态向融合后六螺旋束转变的能量壁垒，从而促进随后的膜融合过程。MBV GPcl对NPC1诱导的构象变化表现出明显的易感性，这可能与其更高的侵入效率有关。
中和纳米抗体对MBV侵入的抑制作用
本研究还从一个免疫了RAVV GP-ΔM的羊驼体内分离并鉴定出一种名为Nanosota-MB1的中和纳米抗体。复合物结构显示，Nanosota-MB1主要通过其互补决定区CDR2和CDR3与GP的RBS结合。其中，CDR2环插入RBS的疏水腔内，与Trp70、Phe72、Met154等疏水残基相互作用，这种结合模式模拟了NPC1-C的loop 2（利用Phe503和Phe504）与同一疏水腔的结合，实现了分子模拟。
SPR竞争实验证明，Nanosota-MB1能够完全阻断NPC1-C与RAVV GPcl的结合。假病毒中和实验表明，Fc标签化的Nanosota-MB1能有效中和RAVV及两种MARV毒株（Musoke和Angola）的假病毒，半数抑制浓度（IC50）约为0.5 µg mL−1，其效力优于已知的人源单克隆抗体。由于MBV GP聚糖帽的部分灵活性，Nanosota-MB1甚至在病毒内吞前就能以高亲和力结合GP，进一步增强了其中和效力。尽管在本研究中主要作为探索MBV侵入机制的工具，Nanosota-MB1也展现出作为抗MBV中和疗法的潜力。
讨论与意义
本研究首次通过结构与功能分析，系统阐明了MBV GP介导高效病毒侵入的机制。研究发现，MBV GP相较于EBOV GP具有多个独特特征：部分灵活、可调控的聚糖帽；与内体受体NPC1截然不同的结合取向和更高的结合亲和力；以及对NPC1结合诱导的构象变化具有显著的易感性。这些特征协同作用，很可能共同导致了马尔堡病毒更高效的细胞侵入能力，这为解释其高病死率提供了重要的分子层面的见解。此外，所发现的、通过模拟受体实现高效中和的纳米抗体Nanosota-MB1，不仅为理解病毒-受体相互作用提供了新视角，也为开发针对马尔堡病毒病的新型治疗策略奠定了坚实基础。这些发现对于全球公共卫生安全和未来大流行病的防范具有重要价值。
