调节性T细胞（Treg）是维持免疫稳态和耐受的关键细胞亚群，其中外周诱导的Treg细胞（pTreg）在体内不断应对外来或改变的自身抗原，对建立广泛的免疫耐受至关重要。虽然已知转化生长因子β（TGFβ）和白介素-2（IL-2）在体外可协同促进pTreg的发育，但如何在体内安全有效地协同利用这两种信号通路，仍是耐受性免疫治疗面临的挑战。
设计并验证IL-2–TGFβ共激动剂
为了应对这一挑战，研究者设计了一种创新的IL-2–TGFβ“模拟”共激动剂。他们将一种源自寄生虫的低亲和力TGFβ模拟激动剂（TGM1）与IL-2通过柔性连接子融合成一个单链融合蛋白，并连接小鼠血清白蛋白以延长其体内半衰期。该设计旨在实现“AND门控”活性，即只有在同时表达IL-2受体和TGFβ受体的细胞上，才能高效激活两条信号通路。研究测试了三种不同IL-2受体β链（IL-2Rβ）亲和力的IL-2变体：野生型、偏好性激活高表达CD25的Treg的N88D变体，以及增强对IL-2Rβ+细胞激活能力的H9变体。
功能验证表明，TGM1–IL-2融合蛋白在表达CD25的CD4+T细胞中，能够有效诱导磷酸化STAT5（pSTAT5）信号，并显著增强SMAD2/3的磷酸化（pSMAD2/3），其活性曲线相比单独的TGM1左移了约2.5个数量级。在体外分化实验中，TGM1–IL-2能够高效地将初始CD4+T细胞转化为FOXP3+pTreg，其效果远超TGM1与IL-2的简单组合。这些诱导产生的pTreg在体外抑制实验中表现出强大的抑制初始T细胞增殖的能力。
体内稳态条件下共激动剂的效果
在稳定状态下，与各自的IL-2变体相比，TGM1–IL-2融合蛋白显著减弱了由IL-2驱动的Treg、CD8+T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）的扩增与激活。例如，IL-2(N88D)能有效扩增脾脏中的FOXP3+Treg，而TGM1–IL-2(N88D)则无此效果。这表明TGM1的融合有效地拮抗了IL-2在稳态条件下对IL-2受体阳性细胞的激活和扩增作用。
共激动剂在OVA免疫小鼠中诱导pTreg
研究进一步在卵清蛋白（OVA）激活模型评估了TGM1–IL-2诱导抗原特异性pTreg的能力。在过继转移了OVA特异性OT-II T细胞并腹腔注射OVA蛋白的小鼠中，TGM1–IL-2（特别是野生型变体）能够在外周淋巴器官（如肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脾脏）中强力诱导高达约80%的OT-II细胞分化为FOXP3+pTreg，其中很大一部分高表达RORγt。而单独的IL-2(WT)或低亲和力TGM1效果甚微。使用药物FTY720阻断淋巴细胞迁移的实验证明，这些RORγt+pTreg可以在各个淋巴器官内局部独立分化。这些诱导的pTreg表现出高表达活化标志物、抑制性分子和归巢受体，功能活跃。
共激动剂建立过敏性耐受
在OVA诱导的气道炎症模型中，预处理TGM1–IL-2(WT)可显著保护小鼠免受过敏反应。与对照组相比，治疗组小鼠肺部炎症评分、血清总IgE和OVA特异性IgE/IgG1水平均显著降低，肺部和支气管肺泡灌洗液中免疫细胞（尤其是嗜酸性粒细胞）浸润减少。同时，在肺、肺引流淋巴结和脾脏中，绝大部分OT-II细胞仍保持为FOXP3+pTreg状态。在OVA诱导的食物过敏模型中，TGM1–IL-2(WT)预处理同样减轻了过敏症状，并在肠道淋巴组织中诱导出大量稳定的RORγt+pTreg。
共激动剂抑制神经炎症
在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35–55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，TGM1–IL-2(WT)同样能高效地将MOG特异性的2D2 T细胞诱导为功能性pTreg。用该蛋白预处理的小鼠，在后续用MOG35–55加完全弗氏佐剂激发时，其EAE临床评分显著降低，大部分小鼠未发病，脊髓中CD4+T细胞、产生干扰素γ（IFNγ）、白介素-17A（IL-17A）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的致病性T细胞数量也大幅减少。
IL-2信号在pTreg诱导和耐受中的作用
为了探究IL-2信号在此过程中的作用，研究者构建了信号缺陷型融合蛋白TGM1–IL-2(DN)。该蛋白保留了诱导pSMAD2/3的能力，但无法激活pSTAT5。实验表明，与TGM1–IL-2(WT)相比，TGM1–IL-2(DN)在体内诱导的OT-II pTreg比例较低，特别是RORγt+亚群，细胞总数和增殖减少，其表面活化、抑制功能相关的分子表达也较弱。更重要的是，在OVA诱导的气道炎症模型中，TGM1–IL-2(DN)所提供的保护作用远逊于TGM1–IL-2(WT)。这证明完整的IL-2信号对于pTreg的最佳分化、扩增、功能成熟及体内耐受的建立至关重要。
诱导的pTreg细胞的转录组学分析
通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析来自不同处理组的OT-II细胞，研究者深入解析了TGM1–IL-2诱导的pTreg的分子特征。与对照组主要富集在常规T细胞（Tconv）簇不同，TGM1–IL-2(WT)处理组的大量OT-II细胞定位在两个pTreg簇，其中一个为增殖活跃的亚群。这些pTreg高表达Treg特征基因、活化及终末效应Treg特征，并特别富集了结肠RORγt+Treg的特征基因程序，包括转录因子RORγt、c-MAF，迁移受体CCR6、CXCR6，以及免疫调节分子IL-10、CTLA4等。TGM1–IL-2(DN)诱导的细胞在这些特征上的富集程度则较弱。功能上，在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中，TGM1–IL-2(WT)预处理诱导的pTreg能有效迁移至肠道，并减轻肠道炎症。差异基因分析进一步揭示了TGFβ和IL-2信号通路的独特与协同调控网络：TGFβ独特地上调Treg身份基因（如Foxp3），IL-2独特地诱导增殖基因，而两条通路的协同激活则共同诱导了一个包含RORγt、c-MAF、BLIMP1等转录因子的效应性pTreg程序，并协同抑制了滤泡辅助性T细胞（TFH）、辅助性T细胞1（TH1）和辅助性T细胞2（TH2）的分化程序。
综上所述，这项研究通过理性设计一种IL-2–TGFβ双特异性共激动剂，成功实现了在体内对特定T细胞的精准、协同信号操控，从而高效生成稳定、功能强大且具有抗原特异性的pTreg。这种策略不仅为治疗多种免疫相关疾病提供了新思路，也为利用工程化细胞因子组合重编程免疫细胞命运建立了概念框架。
