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本研究通过整合单细胞转录组测序（scRNA-seq）、空间转录组学（10x Xenium）及活细胞成像技术，首次对儿童恶性脑肿瘤——幕上室管膜瘤（ST-EPN）的分子亚组、细胞状态、空间组织结构及细胞动态行为进行了系统性多维刻画。研究发现，不同分子亚组（如ZFTA-RELA、ZFTA簇1-4、ST-YAP1）的肿瘤具有独特的神经发育起源（如类神经上皮细胞状态和类胚胎细胞状态）和分化谱系偏好（神经元或室管膜方向）。研究进一步揭示了肿瘤细胞状态的局部与全局空间组织模式，并发现脑内驻留细胞可诱导肿瘤细胞向类神经元状态转变，获得不成熟神经元的迁移形态与行为。该研究为理解ST-EPN的肿瘤异质性及其临床意义提供了多维度框架。
幕上室管膜瘤转录组学鉴定出分子学上不同的亚组
为了全面描述幕上室管膜瘤（ST-EPN）的细胞肿瘤异质性，研究团队收集了来自34名患者的42个肿瘤样本进行单细胞转录组学分析。这些样本涵盖了ZFTA-RELA、ZFTA簇1至4以及ST-YAP1等不同的分子亚组。通过全基因组DNA甲基化分析确认了亚组分类。研究区分了恶性细胞与非恶性细胞，最终保留了7,046个高质量的恶性细胞进行统一处理和分析。结果显示，不同分子亚组的恶性细胞在转录组水平上存在明显差异，并且与不同的人类大脑皮层发育时间点相关联，表明各亚组具有不同的发育模式。
细胞状态映射早期人类大脑皮层
通过非负矩阵分解（NMF）分析，研究在ST-EPN肿瘤中鉴定出8个重复出现的细胞状态“元程序”。其中两个与通用的癌症过程相关，分别是细胞周期程序（表达HELLS、CENPF等基因）和间充质/缺氧程序（表达PGK1、ENO1、CD44等基因）。其余六个程序则与发育过程相关，包括：类胚胎程序（表达ALDH1A2、CTBP2、ACTN4等基因）；类神经上皮程序（表达TUBA1A、ACTG1等基因），该程序强烈映射到发育中人类大脑皮层的神经上皮干细胞；类放射状胶质细胞程序（表达LRIG1、DCLK1等基因）；类胚胎-神经元程序（表达RBFOX1、CNTNAP2等基因）；类神经元程序（表达KIRREL3、NRXN3等基因）；以及类室管膜程序（表达DNAH9、DNAH6等基因）。研究进一步分析了这些细胞状态在不同ST-EPN亚组中的分布比例，发现不同亚组的细胞状态组成存在显著差异。例如，ZFTA-RELA肿瘤主要由类神经上皮、类神经元和类室管膜细胞组成，而ZFTA簇3肿瘤则主要由类胚胎和类胚胎-神经元亚群构成。研究还通过细胞状态图总结了各亚组的谱系偏好，发现不同亚组在向神经元和室管膜谱系分化方面存在差异。
ZFTA-RELA细胞状态的空间定位
研究利用10x Xenium空间转录组学技术，对23名ZFTA-RELA患者的56个肿瘤切片进行了分析。通过结合单细胞RNA测序数据定义的标记基因和融合特异性探针，在空间上注释出了12种细胞类型和状态，包括5种非恶性细胞类型和7种恶性细胞状态。分析证实了空间数据与单细胞数据在细胞状态比例上具有高度一致性，并且在空间数据中检测到了在单细胞数据中未发现的神经元。
全局空间组织模式
对空间数据的分析发现，ZFTA-RELA肿瘤的全局空间组织呈现出两种模式：结构化的肿瘤（细胞状态高度分区化）和混乱的肿瘤（细胞状态分散在整个切片中）。研究通过计算“空间一致性分数”来量化每个肿瘤切片的组织程度。分析表明，更高的空间一致性分数与间充质/缺氧细胞的比例呈正相关，而与类胚胎-神经元细胞的比例呈负相关，提示这两种细胞状态分别与结构化和混乱的肿瘤空间组织相关。
局部空间组织模式
研究进一步分析了细胞状态之间的近端空间关系，以识别肿瘤组织内具有相似邻域的细胞群。通过应用CellCharter算法，在所有56个肿瘤切片中鉴定出了26个稳定的局部空间模式（空间簇）。这些空间簇根据其中最丰富的细胞状态或类型进行分类，包括髓系细胞富集、内皮细胞富集、间充质/缺氧富集、类神经元富集和类神经上皮富集等类型。研究发现，间充质/缺氧、类神经元和类神经上皮等恶性细胞状态倾向于与自身共定位，而髓系和内皮细胞等非恶性细胞则形成不同的局部空间结构。这些空间簇既有样本特异性的，也有在多个样本中共有的，进一步凸显了肿瘤在空间排列上的异质性。
细胞状态的形态学
为了探究肿瘤微环境（特别是神经元和胶质细胞）如何影响肿瘤细胞的形态和功能行为，研究比较了不同ZFTA-RELA患者来源模型（如单培养、与E19大鼠皮层细胞共培养、患者来源异种移植模型）的异质性。研究发现，与正常脑内驻留细胞共培养可诱导肿瘤细胞向更成熟的类神经元状态转变。在共培养和PDX模型中，肿瘤细胞表现出类似于不成熟神经元的膜突起，称为肿瘤微管，并可根据形态分为四个亚型：无突起细胞、有1-3个短初级突起的细胞、有超过3个短初级突起的细胞、有1-3个长初级突起的细胞。通过免疫荧光染色和高分辨率显微镜，研究将分子定义的细胞状态与形态学相关联：Nestin+S100B+的类神经上皮细胞对应无突起或1-3个短突起；CCDC40+Nestin+S100B+的不成熟类室管膜细胞对应超过3个短突起；DCX+Nestin+S100B+的类神经元细胞则对应1-3个长突起。空间转录组学进一步证实了这些形态学亚型的分子特征。
细胞状态的迁移模式
利用活细胞成像技术，研究对不同细胞状态的细胞行为进行了表征。结果显示，类神经元细胞和具有短突起的类神经上皮-2细胞迁移速度最快，而无突起的类神经上皮-1细胞和不成熟类室管膜细胞最为静止。此外，不同细胞状态采用不同的迁移模式：类神经上皮-2细胞多采用连续迁移模式，而类神经元细胞则更频繁地采用跳跃式迁移模式。类神经元细胞的迁移进一步可分为分支迁移、位移和易位三种神经样模式。肿瘤微管的动态行为，包括突起、回缩和分支，也与神经发育过程中的神经元行为相似。在增殖能力方面，具有短突起的类神经上皮-2细胞是增殖最活跃的群体，兼具高迁移和高增殖特性。这些发现在与大鼠E19皮层细胞以及人类诱导多能干细胞来源的神经元和星形胶质细胞共培养的模型中均得到验证，表明这些表型在不同物种的微环境中是保守的。
讨论
该研究首次系统鉴定了ST-EPN各分子亚组（包括先前未充分表征的非经典ST-ZFTA肿瘤）中的恶性细胞状态及其发育特征。研究揭示了ZFTA-RELA肿瘤中不同细胞状态具有独特的空间、形态和行为特征。不同ST-EPN亚组在发育特征和分化谱系上存在明显差异，这为开发针对这些肿瘤的个性化治疗策略奠定了基础。研究强调了缺氧在全局空间结构组织中的作用，以及局部肿瘤结构主要由特定的恶性细胞状态富集。研究进一步整合形态学、免疫荧光、空间转录组学和活细胞成像，证明了在正常脑内驻留细胞背景下，肿瘤细胞状态在分子和表型上的区别。研究发现神经微环境允许ZFTA-RELA肿瘤细胞状态向更成熟的神经元轨迹转变。类神经元细胞表现出长肿瘤微管并采用高迁移行为，类似于发育中的不成熟神经元。同时，研究鉴定出一类独特的细胞群体——类神经上皮-2细胞，兼具迁移和增殖能力。这种细胞状态间的功能分化，可能导致肿瘤内“分工协作”，共同促进癌症进展。总之，这项研究在单细胞水平整合了广泛的转录组、空间、形态和细胞行为学特征，为识别ST-EPN肿瘤迁移、增殖和可塑性相关机制提供了多维分析框架。
