scCirclehunter：基于单细胞ATAC-seq解析胶质母细胞瘤中ecDNA细胞异质性的新框架

本研究针对肿瘤异质性中ecDNA（染色体外DNA）在单细胞分辨率研究不足的问题，开发了scCirclehunter计算框架，首次实现从scATAC-seq数据中识别ecDNA并将其精准分配至特定细胞群。通过分析胶质母细胞瘤（GBM）数据，发现ecDNA携带细胞在患者间和肿瘤空间区域间存在显著异质性，揭示ecDNA通过调控网络重编程（如ecNR2E1驱动FOXO3/CD24通路）和线粒体劫持等新机制促进肿瘤进展。该研究为理解ecDNA驱动肿瘤异质性提供了单细胞精度的新范式。

在肿瘤研究领域，染色体外DNA（ecDNA）正成为解开癌症复杂性的关键拼图。这些环状DNA分子独立于染色体存在，能够携带大量癌基因和调控元件，像“基因加速器”一样驱动肿瘤恶性进展。然而，当前ecDNA研究大多局限于细胞系模型，难以捕捉真实患者肿瘤中复杂的细胞异质性。特别是在单细胞分辨率下，ecDNA如何在不同肿瘤细胞间分布、如何影响细胞状态转变、又如何驱动治疗抵抗，这些核心问题仍悬而未决。

胶质母细胞瘤（GBM）作为最具侵袭性的脑瘤，约60%病例存在ecDNA扩增，是研究ecDNA异质性的理想模型。传统检测方法如批量测序会掩盖细胞间差异，而单细胞测序技术为破解这一难题提供了新机遇。由于ecDNA具有开放染色质特征，单细胞ATAC-seq（scATAC-seq）成为追踪ecDNA细胞分布的潜在利器，但缺乏专门的分析工具。

针对这一技术空白，苏州大学黄沫立团队开发了scCirclehunter计算框架，创新性地将伪批量策略与高斯混合模型结合，首次实现从scATAC-seq数据中识别ecDNA并精准定位至单细胞亚群。该研究通过分析多组GBM患者数据，系统揭示了ecDNA在肿瘤内的分布规律、调控机制及其与细胞状态的关系，相关成果发表于《Cell Discovery》。

研究团队整合了10种癌症的148个scATAC-seq/snATAC-seq数据集，采用优化后的circlehunter2算法进行ecDNA检测，通过高斯混合模型（GMM）或k均值聚类区分ecDNA阳性细胞。针对GBM患者队列，结合scRNA-seq数据解析细胞状态（NPC/OPC/AC/MES样状态），利用ArchR和Seurat工具包进行多组学整合分析。空间异质性研究整合了Hi-C、WES和批量ATAC-seq数据，线粒体转移分析采用MERCI算法推断线粒体DNA劫持事件。

scCirclehunter性能验证

通过模拟数据和真实细胞系混合实验验证工具可靠性。在10X PBMC1k背景数据中，当ecDNA测序深度≥10倍时，检测精度达0.94（F1-score=0.86）。结肠癌细胞系SW480（ecDNA+）与DLD1（ecDNA-）混合实验中，模型区分灵敏度达0.94。与AmpliconArchitect（AA）、ATACamp等工具对比显示，scCirclehunter在核心ecDNA区域检测具有高度一致性，且断点定位更精确。

ecDNA在GBM患者间的异质性

分析4例IDH野生型GBM患者发现，3例携带ecEGFR扩增，1例无ecDNA。ecDNA阳性患者肿瘤细胞高表达DNA修复、细胞周期等特征，而ecDNA阴性患者免疫特征更显著。细胞状态分析显示ecDNA分布于不同状态细胞中，如GBM4275以MES样状态为主，GBM4349以OPC/NPC样状态为主。ecDNA携带基因（如EGFR）在对应患者中染色质可及性显著升高，且拷贝数异质性极大（个别细胞ecEGFR拷贝数>100）。

GBM患者内多ecDNA互作关系

在GBM4349患者中观察到ecMDM4、ecEGFR、ecPDGFRA三种ecDNA共存。ecMDM4普遍存在（与ecEGFR/ecPDGFRA共存），而ecEGFR与ecPDGFRA互斥。ecDNA阳性细胞在ecDNA区域内显示全局染色质开放增强，调控元件活性升高（如ecPDGFRA区富集AP-1家族 motif）。轨迹推断发现三条分化路径，终端状态分别对应携带不同ecDNA组合的MES/AC样细胞。

ecNR2E1的致癌机制

通过配对scATAC+scRNA-seq数据发现，ecNR2E1（携带转录因子NR2E1和免疫基因CD24）驱动独特调控网络。NR2E1通过结合增强子调控FOXO3、PAX6等靶基因，促进干细胞相关通路。CD24与SIGLEC10互作可能介导免疫逃逸。与TCGA数据对比显示，ecNR2E1患者中NR2E1与CD24表达显著正相关（r=0.7），而其他患者无此现象。

ecDNA空间异质性

分析4例GBM多区域样本发现，ecDNA分布存在空间异质性。如P521患者中ecEGFR在7/8区域检测到，而P529患者仅部分区域阳性。Hi-C分析显示ecDNA区域具有特异染色质环互作（如EGFR启动子区400kb环），且ecDNA间存在跨基因组互作（如ecEGFR与ecMDM4）。scATAC-seq信号可准确区分ecDNA阳性与染色体扩增细胞。

ecDNA与线粒体转移关联

基于MERCI算法发现，ecDNA阳性肿瘤细胞线粒体劫持比例更高（P<0.001）。GBM患者中ecDNA阳性细胞G2/M检查点通路富集（NES=1.44），与TCGA中ecDNA患者特征一致（NES=2.21）。ccRCC队列分析显示，ecDNA阳性患者线粒体转移发生率更高（3/6 vs 2/13），提示ecDNA可能通过调控能量代谢促进肿瘤进展。

该研究建立了首个针对scATAC-seq的ecDNA分析框架，揭示了ecDNA在单细胞水平的分布规律和调控机制。发现ecDNA通过改变染色质空间结构、重编程转录网络、促进线粒体劫持等多重途径驱动肿瘤异质性。scCirclehunter为在常规单细胞测序数据中挖掘ecDNA信息提供了经济高效的解决方案，有望推动ecDNA在肿瘤精准治疗中的应用。