蛋白质-核酸语言模型辅助设计高精度紧凑型腺嘌呤碱基编辑器（PNLM-pcABE）推动基因治疗革新

本研究针对腺嘌呤碱基编辑器（ABE）存在的编辑窗口过宽、旁观者编辑和脱靶效应等安全性问题，开发了蛋白质-核酸约束语言模型（PNLM），成功设计出新型编辑器PNLM-pcABE。该工具在保持高编辑效率（43.8-78.6%）的同时，将编辑窗口缩窄至3nt，显著降低DNA/RNA脱靶至背景水平，并通过小鼠模型验证其在疾病建模（酪氨酸酶基因编辑获得100%白化表型）和基因治疗（PCSK9靶向降低血脂）中的应用潜力，为精准基因治疗提供新策略。

基因治疗领域近年来迎来突破性进展，其中腺嘌呤碱基编辑器（ABE）能够实现A·T到G·C的精准转换，有望修复近半数由单核苷酸变异引起的遗传疾病。然而，高效版本如ABE8e存在明显局限性：其宽达6个核苷酸的编辑窗口容易导致旁观者编辑，可能引入新的致病突变；同时较大的蛋白尺寸（约45%的序列冗余）制约了体内递送效率，且存在DNA和RNA水平的脱靶风险。这些安全隐患成为其临床转化的主要障碍。

为突破这一瓶颈，任靖轩等研究团队在《Nature Communications》发表最新研究，创新性地开发了蛋白质-核酸约束语言模型（Protein-Nucleic Acid constrained Language Model, PNLM），通过人工智能辅助设计出新型碱基编辑器PNLM-pcABE。该研究首次将核酸底物信息整合到蛋白质生成模型中，通过迁移学习策略从预训练模型ESM-2中提取嵌入特征，并引入单链DNA序列和编辑位点注释作为约束条件进行微调。模型采用掩码自回归方法模拟自然进化中的插入/缺失变异，成功生成150个TadA-8e变体，包括39个插入型、73个突变型和38个截短型变体。

研究人员通过多层级筛选策略（ESM-1v、AlphaFold2、Rosetta能量评估）优选出20个候选变体进行实验验证。发现在HEK293T细胞中，携带147-152位氨基酸截短的ABE8eΔ147-152变体表现出与ABE8e相当的编辑效率（79.5%），同时将主要编辑窗口从A6-A9缩窄至A6，且显著降低胞嘧啶旁观者编辑。进一步通过连接肽（XTEN linker）删除策略，最终获得45个氨基酸缩减（27%尺寸减小）的PNLM-pcABE。

关键技术创新体现在三个方面：首先建立PNLM模型实现核酸约束的蛋白质设计；其次采用高通量测序（HTS）评估21个内源靶点编辑效率；最后通过改良正交R-loop assay、RNA-seq等技术全面评估脱靶效应。研究还利用临床相关样本（来自ClinVar数据库的GALT c.413C>T和OTC c.533C>T致病突变细胞系）验证治疗潜力。

表征PNLM-pcABE编辑特性

在21个内源靶点测试中，PNLM-pcABE的A-to-G编辑效率（43.8-78.6%）显著高于ABE9（6.2-84.0%），主要编辑窗口（A5-A7）较ABE8e（A3-A8）更精准。特别在A6和A7位点，其编辑效率远超ABE9（p=0.0044和p=0.0005）。通过最高/次高编辑效率比值分析显示，PNLM-pcABE较ABE8e实现1.5-136倍精度提升，且几乎消除胞嘧啶旁观者编辑和indel形成（p<0.0001）。

脱靶效应评估

在63个潜在脱靶位点（包括Cas-OFFinder预测位点和GUIDE-seq/ChIP-seq已知位点）检测中，PNLM-pcABE与ABE9均未检测到DNA脱靶，而ABE8e出现8个脱靶位点。改良R-loop实验表明PNLM-pcABE无sgRNA非依赖性DNA脱靶，RNA-seq结果进一步证实其RNA脱靶事件接近背景水平。

致病突变精准校正

在稳定表达GALT c.413C>T和OTC c.533C>T致病突变的HEK293T细胞中，PNLM-pcABE在GALT A6位点（74.6%）和OTC A6位点（82.0%）的编辑效率显著高于ABE9，同时将有害的A3位点编辑从ABE8e的27.4%降至0.47%。临床变异分析显示，PNLM-pcABE可精准校正3,282个致病突变（NG PAM条件下增至10,354个），在治疗安全性方面展现优势。

动物模型验证

通过小鼠受精卵显微注射PNLM-pcABE mRNA靶向酪氨酸酶基因，成功获得100%携带目标突变（A5位点）的白化模型，且无旁观者编辑（A7位点）。在体内治疗实验中，脂质纳米粒（LNP）包裹的PNLM-pcABE靶向Pcsk9基因剪接位点，实现特异性A6位点编辑（精度较ABE8e提高3.3倍），并显著降低血浆PCSK9和LDL-C水平。

该研究通过结构分析揭示PNLM-pcABE的精准编辑机制：147-152位氨基酸截短重塑了TadA-8e的C末端α螺旋（α5），增强与非靶链DNA（NTS）的相互作用，从而稳定U型构象促进位点特异性脱氨。与ABE9相比，PNLM-pcABE在A6/A7位点编辑效率更高，二者形成互补的精准编辑工具集。

这项研究不仅开发出具有临床应用前景的基因编辑工具，更开创了核酸约束蛋白质设计的新范式。PNLM-pcABE凭借其高精度、小尺寸和低脱靶特性，为遗传疾病治疗、疾病模型构建及基础研究提供了全新解决方案，标志着AI驱动生物技术开发进入新阶段。