### 背景与目的
染色体三维结构对基因表达调控至关重要，而这一结构的重建发生在细胞周期切换的关键阶段——有丝分裂结束进入G1期。传统观点认为，染色体折叠主要依赖细胞质中传递的蛋白质和信号。然而，近年研究表明染色体本身可能携带独立于细胞质的折叠信息。本文通过阻断核质运输（如降解核输入因子RanGAP1和Nup93），结合Hi-C、ATAC-seq、CUT&RUN等技术，解析了染色体折叠的两种机制：**染色体内在机制**（基于表观遗传标记和已形成的环结构）和**细胞质传递机制**（依赖新进入核的共定位因子）。研究旨在阐明这两种机制如何协同作用以重建细胞类型特异的染色质结构。
### 实验方法概述
1. **核输入因子功能验证**：
使用CRISPR技术将RanGAP1和Nup93与降解标记（AID）结合，通过诱导降解阻断核输入。RanGAP1是RanGTP梯度维持的关键蛋白，Nup93是核孔复合体组装的必需因子。通过流式细胞术和荧光显微镜验证核膜重建及核体积变化。
2. **Hi-C技术解析染色体 folding**：
在G1期、中后期等不同时间点收集细胞，利用Hi-C（染色体构象捕获）技术绘制染色体相互作用图谱。通过比较处理组（如RanGAP1/NDup93缺失）与野生型，分离出染色体内在机制与细胞质依赖机制的影响。
3. **染色质可及性分析**：
使用ATAC-seq（全基因组ATAC测序）和CUT&RUN（染色质结合足迹分析）检测染色质开放区域。结合H3K27ac、H3K4me3等表观标记，定位调控元件（如增强子、启动子）的染色质分布。
4. **转录动态与核蛋白定位**：
通过SLAM-seq追踪新生RNA的合成时间，结合免疫荧光定位cohesin、CTCF等关键蛋白，分析其与染色质环结构的动态关联。
### 主要发现
#### 1. **染色体内在机制驱动微分区（Microcompartments）**
在核输入受阻的条件下（如RanGAP1缺失），染色体仍能形成由**增强子、启动子等活性调控元件（cCREs）**构成的密集微分区（MCDs）。这些MCDs表现为：
- **短程高特异性相互作用**：即使缺乏细胞质传递的共定位因子，MCDs间仍存在显著且非随机的高频接触，表明其依赖染色体固有属性（如CTCF结合位点或表观标记）。
- **动态可逆性**：微分区的强度随细胞周期阶段变化，例如在G1早期因cohesin介导的环外推而逐渐被打破，但在无核输入时（如RanGAP1缺失），这种打破被抑制，导致MCDs持续强化。
- **表观遗传印记**：MCDs高度富集H3K4me3（活性染色质）和H3K27ac（增强子标记），并通过CUT&RUN验证其染色质结合因子（如BET蛋白）的共定位。
#### 2. **细胞质传递机制调控大尺度亚分区（Subcompartments）**
核输入的恢复（如RanGAP1复现）导致两种机制的协同作用：
- **cohesin介导的环外推与TAD边界形成**：在G1期，cohesin通过外推形成染色体环（如CTCF-CTCF环），这些环进一步将基因组划分为异染色质（B）和均染色质（A）亚分区。核输入受阻时，cohesin无法有效加载或循环，导致大尺度亚分区（如A/B compartment）的弱化。
- **动态剪接（Pruning）与空间约束**：通过Hi-C数据比较发现，在G1期，MCDs间的长程非特异性接触被cohesin环选择性保留或剔除（例如，仅保留与自身亚分区（如A1、A2）的接触）。这种“剪接”过程依赖核输入传递的共定位因子（如RNA Pol II、组蛋白修饰酶）。
- **BET蛋白的作用局限**：尽管BET蛋白（如Brd2/4）参与增强子-启动子互作，但抑制BET活性并不影响MCDs的形成，表明微分区的形成独立于这些因子，可能由H3K27ac本身直接介导的染色质桥接作用驱动。
#### 3. **mitotic bookmarking（mitotic标记）的机制**
在核输入受阻的条件下，染色体仍能保留以下关键特征：
- **CTCF结合位点的持续存在**：CTCF蛋白在mitotic exit后迅速富集于染色体，形成环状结构，并通过CUT&RUN验证其染色质结合状态。
- **表观遗传记忆的传递**：H3K4me3和H3K27ac标记在mitosis中部分保留，提示染色质状态通过“非编码RNA或DNA结合蛋白”传递至子细胞。
- **动态的核结构重建**：在telophase（有丝分裂后期），染色体形成临时微分区（如5-125 kb尺度的密集互作），随后在G1期被cohesin环进一步整合，形成稳定的亚分区。
### 讨论与意义
#### 1. **染色体折叠的“双轨制”模型**
研究提出染色体三维结构重建的两种独立但互补的机制：
- **第一轨（染色体内在机制）**：由CTCF、cohesin等因子介导，依赖染色体固有表观遗传状态（如H3K27ac、H3K4me3）和已形成的环结构（如CTCF-CTCF环）。这一轨在mitotic exit后立即启动，形成非特异性微分区。
- **第二轨（细胞质传递机制）**：依赖新进入核的共定位因子（如cohesin亚基、RNA Pol II、组蛋白修饰酶），通过动态调整微分区的长程互作，最终形成细胞类型特异的亚分区（如A1、A2）。
#### 2. **微分区的功能与演化**
- **功能**：微分区可能作为“基因调控单元”，通过短程互作快速激活增强子-启动子网络，例如在G1早期驱动促发基因（ early-response genes）的转录。
- **演化**：在mitotic exit阶段，微分区先于亚分区形成，并在G1期通过cohesin环的修剪（pruning）进一步整合。例如，在RanGAP1缺失的细胞中，MCDs的互作强度与野生型无显著差异，但无法被cohesin环覆盖，导致大尺度亚分区弱化。
#### 3. **细胞质依赖机制的关键作用**
- **cohesin的招募与循环**：cohesin依赖核输入因子（如RanGAP1）的活性状态进入染色体，并通过外推形成环。当核输入受阻，cohesin无法在G1期持续积累，导致环结构松散。
- **转录与染色质的耦合**：SLAM-seq显示，G1期转录活性（如新RNA合成）与cohesin环的动态重建同步。核输入受阻时，转录停滞，但染色质仍保留微分区的互作网络，表明其独立性。
#### 4. **与现有理论的冲突与融合**
- **与“增强子-基因环”模型的冲突**：传统模型认为增强子-基因环的形成依赖细胞质信号（如cohesin招募），但本文发现微分区在无细胞质输入时仍能存在，提示其可能通过更基础的“表观遗传记忆”形成。
- **与“空间分离”假说的融合**：研究支持染色质结构由“表观遗传驱动的大尺度亚分区”和“功能导向的短程微分区”共同构成。例如，A/B亚分区通过CTCF环划分，而MCDs进一步细化调控元件的互作。
### 结论
1. **染色体内在机制主导微分区形成**：即使完全阻断核输入，染色体仍能基于表观遗传标记和CTCF环形成微分区。
2. **细胞质传递机制调控大尺度结构**：cohesin介导的环外推和转录因子共定位是亚分区形成的关键。
3. **动态平衡的折叠网络**：微分区在mitotic exit后迅速形成，随后被cohesin环整合并修剪，最终形成细胞类型特异的染色质结构。
### 局限性与未来方向
- **局限性**：研究主要基于人类DLD-1细胞，未来需验证其他物种或肿瘤细胞中的机制。
- **未解问题**：微分区的具体功能（如是否直接参与转录调控）仍需通过基因敲除或CRISPR干涉实验验证。
- **技术延伸**：结合单细胞Hi-C和空间转录组（如slidenumber），可进一步解析微分区与转录活性位点的空间关联。
本文为染色体三维结构的重建机制提供了新的理论框架，强调染色体内在属性与细胞质动态输入的协同作用，为疾病（如癌症中的染色质异位）的靶向治疗（如抑制核输入因子）提供了新思路。
