长链非编码 RNA GDIL 在结直肠癌铂耐药中的关键作用及机制研究解读

复旦大学附属华山医院的研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Long noncoding RNA GDIL acts as a scaffold for CHAC1 and XRN2 to promote platinum resistance of colorectal cancer through inhibition of glutathione degradation” 的论文。该研究发现了长链非编码 RNA（lncRNA）GDIL 在结直肠癌铂耐药中的关键作用，为克服铂耐药提供了新的潜在治疗靶点，对改善铂类化疗效果具有重要意义。

一、研究背景

铂类药物在多种癌症化疗中广泛应用，但癌细胞对铂类药物产生的获得性耐药严重限制了其疗效。癌细胞抵抗化疗的重要机制之一是通过高度活跃的抗氧化系统减轻药物诱导的活性氧（ROS）造成的致命损伤。谷胱甘肽（GSH）作为细胞内最丰富的抗氧化剂，在对治疗不敏感的肿瘤组织中含量增加。虽然阻断 GSH 合成被认为是一种有前景的癌症治疗方法，但相关药物在临床应用中效果不佳，且非选择性的 GSH 消耗剂可能对非恶性组织造成不可逆损伤。此外，GSH 降解对化疗耐药表型的贡献尚不清楚。因此，揭示 GSH 代谢的调控机制，寻找新的调控途径和靶点，对于克服癌症化疗耐药至关重要。

二、研究材料与方法

细胞：使用来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）的人胚肾 293T 细胞、卵巢癌细胞系（SKOV3 和 OVCAR3）和结直肠癌细胞系（SW480 和 HCT116），并通过细胞系 STR 分析进行鉴定。细胞在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO₂的湿润环境中培养，且在实验前至少传代 3 次并检测无支原体污染。
患者和临床标本：从复旦大学附属华山医院收集 90 例结直肠癌组织标本，严格遵循纳入和排除标准筛选患者。依据实体瘤疗效评价标准（RECIST）评估患者治疗反应，组织样本冻存于 -80°C 备用。该研究经华山医院伦理委员会批准，患者均签署书面知情同意书，研究遵循 1975 年《赫尔辛基宣言》开展。
实验技术：运用转录组分析、RNAscope 检测、非靶向和靶向代谢组学分析、同位素示踪分析、GSH 定量、结直肠癌异种移植实验、生物素下拉实验和质谱分析、MS2 下拉实验、RNA 免疫沉淀、荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光等多种实验技术，并通过统计分析对实验数据进行处理和解读。

三、研究技术路线

研究人员首先对铂耐药和 parental 癌细胞进行转录组分析，筛选出差异表达的基因，进而发现 lncRNA GDIL。随后对其功能进行验证，利用多种组学技术探究 GDIL 对 GSH 代谢的影响。通过一系列分子生物学实验，如 RNA pull-down、RIP 等，明确 GDIL 与相关蛋白和 mRNA 的相互作用关系，深入剖析其调控铂耐药的分子机制。最后，构建异种移植模型，评估靶向 GDIL 对铂耐药的治疗效果。

四、研究结果

GDIL 在奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞中上调：对奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞系进行转录组分析，发现 86 个 mRNA 和 7 个 lncRNAs 上调。在候选基因中，敲低 GDIL 显著降低奥沙利铂处理下的细胞活力。临床样本分析显示，GDIL 水平与结直肠癌患者死亡风险正相关，高表达 GDIL 与较短的无病生存期相关，且化疗过程中 GDIL 表达会激活，表明其促进铂耐药，是结直肠癌复发的潜在生物标志物。
GDIL 抑制细胞内 GSH 降解：对敲低 GDIL 的 HCT116OR 细胞进行 RNA 测序和非靶向代谢组学分析，发现 GSH 代谢途径是受 GDIL 调控的关键途径之一。靶向代谢组学和同位素示踪分析证实，GDIL 通过抑制 GSH 降解促进其积累。当 GSH 合成被抑制时，敲低 GDIL 加速细胞内 GSH 消耗，而过表达 GDIL 则减缓 GSH 消耗。
GDIL 诱导的 GSH 积累是铂耐药所必需的：敲低 GDIL 导致细胞内 ROS 水平升高，利用 NAC 中和 ROS 可挽救因 GDIL 敲低导致的细胞活力下降。在异种移植模型中，GDIL 敲低使奥沙利铂耐药的 HCT116 CDXs 对治疗重新敏感，但联合 NAC 处理会阻断该效果。补充外源性 GSH 能显著消耗 ROS 并挽救铂诱导的细胞死亡，表明 GDIL 通过维持高水平 GSH 诱导铂耐药。
GDIL 下调 CHAC1 以抑制 GSH 降解：分析 GDIL 敲低和对照细胞的 RNA 测序数据，发现 CHAC1 是 GDIL 的潜在下游靶基因。敲低 CHAC1 诱导 GSH 上调、ROS 消耗并抑制药物诱导的细胞凋亡，而过表达 CHAC1 则产生相反效果。体内实验也证实，CHAC1 上调使 GDIL 过表达的 HCT116 - CDX 模型对铂治疗重新敏感，表明 CHAC1 直接参与 GDIL 介导的 GSH 降解抑制和铂耐药过程。
GDIL 结合并介导 CHAC1 转录本的降解：通过分析 RNA 序列，发现 GDIL 与 CHAC1 mRNA 存在互补区域，经生物素下拉实验和荧光素酶报告实验验证二者存在物理相互作用。阻断 RNA 合成后检测发现，敲低 GDIL 延迟 CHAC1 mRNA 降解，过表达 GDIL 则加速其降解，且 CHAC1 mRNA 的半衰期不受与 CHAC1 结合序列突变的 GDIL 过表达影响。
GDIL 通过 XRN2 促进 CHAC1 mRNA 降解：RNA 下拉和质谱分析鉴定出与 GDIL 结合的蛋白，其中 XRN2 也与 CHAC1 mRNA 相互作用。通过体内 MS2 下拉 / 免疫印迹和 RIP 实验证实了 GDIL 与 XRN2、CHAC1 mRNA 与 XRN2 的结合。进一步研究发现，GDIL 的 1 - 200 nt 片段和 CHAC1 mRNA 的 950 - 1100 nt 片段是与 XRN2 相互作用所必需的，且 XRN2 的羧基末端区域和催化结构域分别负责与 GDIL 和 CHAC1 mRNA 结合。敲低 GDIL 减少 CHAC1 mRNA 与 XRN2 的结合，过表达 GDIL 则增加结合，缺失 GDIL 的 1 - 200 nt 片段会阻断 GDIL 对 CHAC1 mRNA 降解等相关作用。
靶向 GDIL 可延缓铂耐药：利用特异性锁核酸（LNA）修饰的反义寡核苷酸（ASO）靶向 GDIL，在 HCT116 - CDX 和 SKOV3 - CDX 小鼠模型中，联合铂类药物治疗可延迟肿瘤复发，增强铂类药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用并促进细胞凋亡，同时使 CHAC1 蛋白上调。在患者来源的异种移植（PDX）模型中也得到类似结果，表明 GDIL 是延缓铂耐药的潜在靶点。
GDIL 结合 XRN2 并诱导其细胞质易位：纯化 poly (A)+ RNAs 证明成熟加工的 CHAC1 mRNA 分别与 GDIL 和 XRN2 结合，且 GDIL 过表达加速 poly (A)+ CHAC1 mRNA 降解，缺失 1 - 200 nt 片段则阻断该效果。通过 RNA 荧光原位杂交和免疫荧光染色发现，在亲本结直肠癌细胞中，XRN2 主要定位于细胞核，而在耐药细胞中，部分 XRN2 与 GDIL 共定位在细胞质中。敲低 GDIL 不能使耐药细胞中 XRN2 从细胞核重新定位到细胞质，而过表达 GDIL 则促进亲本细胞中 XRN2 向细胞质易位，缺失 1 - 200 nt 片段会阻断该作用，免疫印迹实验进一步验证了这一结果。

五、研究结论

本研究发现 lncRNA GDIL 在铂耐药的结直肠癌和卵巢癌细胞中上调，高表达 GDIL 与结直肠癌患者预后不良相关。GDIL 通过抑制 GSH 降解促进其积累，进而清除铂诱导的 ROS，增强癌细胞对铂类药物的抗性。其作用机制是 GDIL 作为支架分子，结合并将核蛋白 XRN2 重新定位到细胞质，与 CHAC1 mRNA 形成三元复合物，促进 CHAC1 mRNA 降解，下调 CHAC1 表达，从而抑制 GSH 降解。靶向抑制 GDIL 可恢复铂耐药细胞系的药物敏感性，在细胞系和患者来源的异种移植模型中延缓铂耐药，为克服铂耐药提供了新的潜在治疗靶点。

六、讨论

铂类药物在癌症化疗中应用广泛，但耐药问题严重限制其疗效。本研究首次鉴定出 lncRNA GDIL 是铂耐药的关键驱动分子，揭示了其通过调控 GSH 降解影响铂耐药的新机制。以往针对 GSH 合成的癌症治疗策略临床效果不佳，而本研究表明靶向 GSH 降解途径的 GDIL 具有潜在治疗价值。虽然目前尚未明确除 XRN2 外参与 CHAC1 mRNA 衰变的脱帽因子，但这为后续研究提供了方向。在临床应用方面，ASO 药物已获批准，本研究中奥沙利铂联合 GDIL ASO 在模型中显著抑制肿瘤复发，为铂耐药患者的治疗提供了新方案，值得进一步开展临床试验验证，有望改善铂耐药患者的预后。