蠕动泵引发淀粉样蛋白形成：体内剪切应力或为淀粉样蛋白成核风险的研究解读

近期，大阪大学工程研究生院的研究人员 Yuji Goto、Tomoki Ota 等人在npj Biosensing期刊上发表了题为 “Peristaltic pump-triggered amyloid formation suggests shear stresses are in vivo risks for amyloid nucleation” 的论文。该研究揭示了蠕动泵流动可有效引发淀粉样蛋白形成，表明体内剪切应力可能是淀粉样蛋白成核的风险因素，这一成果为理解淀粉样蛋白相关疾病的发病机制提供了新视角，在神经退行性疾病等研究领域具有重要意义。

一、研究背景

淀粉样蛋白原纤维是变性蛋白质形成的晶体状纤维聚集体，与阿尔茨海默病、帕金森病等一系列淀粉样变性疾病密切相关。其形成与蛋白质过饱和状态的破坏有关，在体外，已有多种机制可在无种子条件下促使淀粉样蛋白原纤维形成，而体内破坏蛋白质过饱和状态的因素却尚不明确。

流体流动应力作为引发体内淀粉样蛋白成核的机械触发因素，受到越来越多的关注。血液、脑脊液等流体在微观尺度下的流动会产生多种应力，如层流剪切应力和拉伸流应力，这些应力被认为可能触发蛋白质聚集。但以往研究未考虑过饱和状态在流体流动应力中的作用，推测流动应力的直接作用可能是破坏原本稳定的过饱和状态，进而引发淀粉样蛋白形成。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

研究使用的蛋白质包括重组人 α - 突触核蛋白（αSN）、重组人 β2 - 微球蛋白（β2m）、鸡卵清溶菌酶（HEWL）和淀粉样 β1 - 40（Aβ40）。其中，αSN、β2m 分别在大肠杆菌中表达并纯化，HEWL 和 Aβ40 购自相应公司。荧光染料硫代黄素 T（ThT）用于检测淀粉样蛋白原纤维，其他试剂也均从商业渠道获取。

（二）实验方法

蠕动泵引发淀粉样蛋白形成实验：将不同蛋白质溶解在特定缓冲液中，使其终浓度达到实验要求，并加入 5 μM ThT。利用蠕动泵驱动蛋白质溶液在循环系统中流动，通过荧光分光光度计监测 ThT 荧光强度变化，以确定淀粉样蛋白原纤维的形成情况。同时，使用不同类型蠕动泵进行实验，考察蠕动泵引发淀粉样蛋白形成的普遍性。
超声引发淀粉样蛋白形成实验：以日立荧光分光光度计为基础，利用超声波发生器对玻璃比色皿中的样品溶液发射超声脉冲，测量超声引发的淀粉样蛋白形成过程。
圆二色谱（CD）和透射电子显微镜（TEM）测量：使用 J - 820 分光偏振计在 20℃下测量远紫外 CD 光谱，用于分析蛋白质二级结构；利用透射电子显微镜（JEOL JEM - 1400）观察样品的微观形态，确定淀粉样蛋白原纤维的形成。
有限元方法（FEM）模拟：运用 COMSOL Multiphysics ver. 6.2 软件，结合固体力学和流体力学计算，模拟蠕动泵转子运动时溶液中的剪切应力分布。
理论分析：基于两步原纤维形成模型，建立描述淀粉样蛋白形成过程中单体和产物浓度变化的方程，通过有限差分法求解方程，模拟蠕动泵流动体系中的淀粉样蛋白形成行为。

三、研究结果

（一）蠕动泵引发 HEWL 淀粉样蛋白形成

在 pH 2 和 2.0 M 盐酸胍（GuHCl）条件下，使用蠕动泵驱动 HEWL 溶液流动，回收溶液检测发现 ThT 荧光显著增强，表明有淀粉样蛋白原纤维形成。构建循环系统监测发现，ThT 荧光在 HEWL 溶液首次流经荧光计时有明显增加，之后每 20 min 出现峰值，且峰值和基线强度不断上升，最终达到饱和，这表明淀粉样蛋白形成和稀释在循环中同时进行。通过交换蠕动泵和荧光探测器位置、流动色氨酸溶液作对照等实验，证实反应触发因素是蠕动泵。荧光显微镜观察到不同大小的 ThT 阳性聚集体流动，呈现出层流特征，且聚集体有翻滚和形态变化。TEM 和 CD 测量进一步确认 ThT 阳性聚集体为淀粉样蛋白原纤维，不过 CD 光谱因蛋白质吸附于管壁无法准确反映产物二级结构。与注射器泵实验对比，蠕动泵诱导淀粉样蛋白原纤维形成的效果更显著。

（二）α - 突触核蛋白（αSN）的淀粉样蛋白形成

在 pH 7.0 和 0.5 M 条件下，蠕动泵系统使 αSN 溶液在首次通过荧光计时，ThT 荧光明显增强，表明引发了淀粉样蛋白形成。荧光显微镜观察到 αSN 形成簇状绒毛样聚集体，有剪切流依赖的动态运动。TEM 显示回收溶液中有典型淀粉样蛋白原纤维图像，CD 光谱常无典型 β 谱。研究 ThT 荧光动力学与 αSN 用量关系，结果与 HEWL 相似，表明蠕动泵在首轮即可触发淀粉样蛋白成核，后续受生长和吸附影响。

（三）淀粉样 β1 - 40（Aβ40）的淀粉样蛋白形成

蠕动泵同样能在 Aβ40 溶液首次通过时触发淀粉样蛋白形成，监测 ThT 荧光可发现后续循环中，因吸附于管壁，峰值强度下降。荧光显微镜观察到层流中大型淀粉样聚集体流动，Aβ40 原纤维黏性大，易自聚集、吸附于流动池表面并脱落，可能导致体内通道堵塞。TEM 显示其刚性淀粉样形态，CD 光谱表明单体向 β - 片层结构转变，但因吸附难以精确评估。与超声诱导的 Aβ40 淀粉样蛋白形成相比，蠕动泵诱导的 ThT 荧光值较低，但仍能有效形成 Aβ40 淀粉样蛋白原纤维。

（四）β2 - 微球蛋白（β2m）的淀粉样蛋白形成

在 pH 1.8 和 0.4 M NaCl 条件下，蠕动泵可触发 β2m 淀粉样蛋白形成；在 pH 7.0 和 0.5 mM SDS 存在时，出现有趣的两步淀粉样蛋白形成过程，首次通过蠕动泵时 ThT 荧光显著增强，后续循环出现振荡峰，数小时后荧光再次逐渐增加，形成绒毛样聚集体，经 TEM 确认为淀粉样蛋白原纤维。在无 SDS 的 pH 7.0 条件下，仅出现第一步，且超声也无法引发淀粉样蛋白形成，TEM 观察到小聚集体，类似报道的寡聚体。研究还发现 SDS 诱导的 β2m 寡聚体有助于在中性 pH 条件下促进种子依赖的淀粉样蛋白生长，而蠕动泵诱导的寡聚体形成与 β2m 浓度无关，显示出蠕动泵的强大作用。

（五）有限元方法（FEM）模拟

通过 FEM 模拟蠕动泵转子运动时溶液中的剪切应力分布，发现转子运动可产生高于 100 Pa 的显著大剪切应力，远高于层流产生的最大剪切应力（实验条件下约 0.02 Pa）。减小转子首次推动时剩余溶液层厚度、增加转子数量可进一步增大剪切应力。在实验条件下，流体流动处于层流状态（Re 值约为 2），荧光显微镜图像也证实了这一点。不过，直接观察蠕动泵内部聚焦于管与转子相互作用，对阐明淀粉样蛋白成核细节具有重要意义。

（六）动力学分析

提出的理论模型考虑了化学反应、自扩散和轴向流对单体和产物浓度的影响，虽能部分解释轴向流条件下的原纤维形成实验结果，但在模拟初始单体量小的实验时存在不足。实验中因蠕动泵强诱导能力，开始即有一定量原纤维产生，且原纤维吸附会减少流动中的原纤维；而模拟中原纤维量是逐渐增加的，这种差异可能与空间时间定位有关。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

研究表明，蠕动泵能够强大且有效地触发多种蛋白质的淀粉样蛋白形成，包括 HEWL、αSN、Aβ40 和 β2m。通过 FEM 模拟发现，蠕动泵转子运动可产生极大的剪切应力，这很可能是引发淀粉样蛋白成核的关键机械因素，意味着体内的剪切应力也可能打破蛋白质的过饱和状态，从而触发淀粉样蛋白形成，最终导致淀粉样变性疾病。

（二）讨论

虽然研究确定了剪切力是重要因素，但剪切力如何打破过饱和状态仍不清楚，且淀粉样蛋白在蠕动泵内部的成核位置（体相或表面）也不明确，未来对蠕动泵内部的直接观察有助于解决这些问题。实验中淀粉样蛋白原纤维吸附于循环系统内表面使动力学观察复杂化，但这种复杂性模拟了体内淀粉样蛋白沉积过程，如黏性 Aβ 图像可能模拟脑淀粉样血管病早期阶段，β2m 寡聚体闪烁现象可能在透析患者中出现。此外，蠕动泵系统虽简单却能有效监测易感性风险生物标志物，为早期诊断提供了新途径；从过饱和限制淀粉样蛋白形成角度出发，降低过饱和度的治疗策略可能比抑制淀粉样蛋白形成更有效，蠕动泵系统有望实现实时、微升尺度的剪切应力诱导淀粉样蛋白形成的成像和动力学分析，为相关疾病研究和治疗带来新的方向。