集成培养箱的电化学分析平台：细胞研究的创新利器

伊兹密生物医学与基因组中心（Izmir Biomedicine and Genome Center）的研究人员 Fatma Kurul、Meryem Beyza Avci 等人在npj Biosensing期刊上发表了题为 “Incubator-integrated electrochemical analysis platform for cell-based studies” 的论文。该研究成果在细胞研究领域意义重大，为深入探究细胞行为、评估药物疗效等提供了创新的技术手段，有望推动药物筛选和个性化医学的发展进程。

电化学分析方法凭借其响应迅速、成本效益高、灵敏度和选择性强等优势，在众多领域广泛应用，在细胞分析方面也崭露头角。它能检测细胞分泌的生物标志物，或通过与细胞直接接触来测定细胞特性。然而，现有基于电化学方法的细胞研究存在明显缺陷。在实验过程中，细胞常需从模拟体内环境的培养箱（37°C、5% CO₂ ）中取出，在与培养环境不同的条件下进行测试，比如温度降低、因 CO₂ 水平变化导致 pH 改变等。这些外部因素会对细胞产生应激，干扰细胞行为和增殖，进而影响细胞测试的准确性。此外，在不合适的培养环境中，将细胞接种在丝网印刷电极（SPE）表面后，需将 SPE 置于商业 CO₂ 培养箱中一段时间，这可能导致 SPE 表面性质恶化，进一步影响实验结果的可靠性。

研究选用贴壁的乳腺癌细胞系 MCF-7，将其培养在含有 RPMI 1640 培养基、10% 胎牛血清、青霉素（100 单位 /mL）和链霉素（100 μg/mL）的 75 cm² 培养瓶中，培养条件为 37°C、5% CO₂ 的湿润培养箱。当细胞达到 80% 汇合度时，通过胰蛋白酶消化使其从培养瓶表面脱离，并悬浮在新鲜培养基中。在细胞悬浮过程中，使用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行冲洗 。

采用丝网印刷碳电极（Metrohm DropSens）和 PalmSens4 手持式分析仪进行电化学测量。为提高测量的稳定性、灵敏度、电极寿命和整体可靠性，每个新的 SPE 在使用前需用差分脉冲伏安法（DPV）进行预处理，以去除表面生产相关杂质。优化后的预处理条件为在 100 µL 醋酸盐缓冲液（ACB）中，施加 + 1.8 V 电位 60 s。0.5 M 醋酸盐缓冲液（pH 4.8）中含有 20 mM 氯化钠。在每次测量前，用 1× PBS 缓冲溶液（pH 7.4）轻轻清洗电极表面。在电化学阻抗谱（EIS）测量中，在 0.1 Hz 至 100 kHz 的频率范围内施加 10 mV 的交流振幅，记录不同频率点的电阻响应。循环伏安法（CV）分析时，在 - 0.6 至 +0.6 V 的电位范围内，以 50 mV/s 的扫描速率记录电流响应。DPV 测量则在 - 0.4 至 +0.8 V 的范围内，以 50 mV/s 的扫描速率进行。激活后的 SPE 置于样品制备装置中，细胞接种在 SPE 表面，然后在 37°C、5% CO₂ 和 95% 湿度的商业培养箱中孵育过夜。孵育后，吸出电极表面的细胞培养基，用 1× PBS（pH 7.4）清洗 SPE，最后使用 10 mM K₄[Fe (CN)₆]/K₃[Fe (CN)₆] 在 0.1 M KCl 中的电化学活性氧化还原反应进行测量 。

紫杉醇（PTX）购自美国休斯敦的 Selleck Chemicals。将 PTX 溶解在无水二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 50 mM 的储备溶液，再用培养基稀释。激活后的 MCF-7 细胞以 5×10⁵ 个 /mL 的密度接种在 SPE 表面的培养基中，在商业培养箱中过夜培养。细胞贴壁后，更换含有不同浓度 PTX（1 nM、5 nM 和 50 nM）的培养基，处理 24 h。之后吸出电极表面的药物培养基，用 1× PBS（pH 7.4）清洗 SPE，最后在 10 mM K₄[Fe (CN)₆]/K₃[Fe (CN)₆] 的 0.1 M KCl 溶液中进行电化学测量 。

利用扫描电子显微镜（SEM，Zeiss）观察接种在 SPE 上的细胞形态结构。细胞以 0.5×10⁴ 个 /mL 的密度接种，在 37°C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 24 h 后，去除培养基，用 1× PBS（pH 7.4）冲洗 SPE 表面，接着用 2.5% 戊二醛固定 1 h，再依次用 PBS、蒸馏水清洗，并用梯度绝对乙醇（35%、60%、80%、90% 和 100%）脱水，用干燥试剂（HMDS / 乙醇 1:1）处理后风干，最后在 SEM 检测前用溅射镀膜机在 SPE 表面镀上金纳米颗粒，在 8000 倍放大倍数、20 mm 工作距离和 15 kV 电子高压下采集图像。借助共聚焦显微镜（Zeiss）观察接种在 SPE 表面细胞的染色细胞核和肌动蛋白丝。MCF-7 细胞以 2.5×10⁵ 个 /mL 的密度接种，在 37°C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 24 h，清洗后用 4% 多聚甲醛固定，再用 0.1% Triton X-100 透化处理，在黑暗中用鬼笔环肽孵育，加入 DAPI 工作溶液孵育后清洗，分别用 543 nm（鬼笔环肽）和 405 nm（DAPI）激发波长进行观察 。

研究团队开发的集成培养箱的电化学分析平台主要由四个模块组成，各模块协同工作，实现对细胞的精准电化学测量。微流控模块包含流动池和泵 - 歧管配置，流动池由两个树脂基锁定帽和两个聚二甲基硅氧烷（PDMS）基密封层构成，确保 SPE 与细胞及测量溶液充分接触，并精确控制液体输送；泵 - 歧管配置由四个压电泵和集成电磁阀组成，通过调节电压控制不同溶液的流速。培养箱模块分为溶液箱和测试箱，溶液箱通过正温度系数（PTC）加热器、风扇和 CO₂ 气体调节温度和 pH，测试箱则主要控制温度，两者均利用比例 - 积分 - 微分（PID）控制器精准维持所需的培养条件 。测量模块由 SPE、电位计和连接器组成，可与任何商业电位计集成，通过 EIS、CV 和 DPV 等技术实时监测细胞的电化学特性。软件模块基于 C# 语言在 Microsoft Visual Studio 中开发图形用户界面（GUI），实现对硬件模块的控制、电化学测量操作以及数据处理和分析功能，方便研究人员进行实验操作和结果分析。此外，还开发了样品制备装置，用于在商业培养箱中接种细胞，该装置能保护 SPE 连接不受培养箱潮湿环境影响，促进细胞黏附，为后续实验奠定基础。

通过对比实验，利用 EIS、CV 和 DPV 技术监测 MCF-7 细胞在有无样品制备装置情况下的电化学光谱。EIS 分析表明，使用样品制备装置时，细胞在早期（3 - 9 h）黏附较弱，12 h 后电荷转移电阻显著增加，24 h 时阻抗大幅上升，表明细胞与 SPE 表面的相互作用增强，黏附力变强；而未使用样品制备装置时，即使孵育 24 h，细胞黏附依然较弱。CV 和 DPV 分析结果也与 EIS 一致，使用样品制备装置时，随着孵育时间延长，氧化还原峰电流信号变化明显，反映出细胞黏附对电极表面电化学过程的影响；未使用时，细胞黏附弱，电流信号变化不显著 。

研究不同细胞密度对 SPE 电化学性质的影响，通过接种不同密度的 MCF-7 细胞（2.5×10⁵ - 2×10⁶ 个 /mL）并孵育 24 h，利用 EIS、CV 和 DPV 进行检测。EIS 结果显示，随着细胞密度增加，阻抗增大，这是由于更多非导电的细胞膜覆盖电极表面，阻碍了电荷转移；CV 和 DPV 结果表明，峰电流信号随细胞密度增加而降低，因为细胞增多阻碍了电活性物质到达电极表面，增加了电荷转移电阻。这表明该平台能够区分低至 2.5×10⁵ 个 /mL 的细胞密度，可用于长期培养研究中监测细胞增殖 。

以 PTX 和 MCF-7 细胞系为研究对象，评估平台对标准治疗药物（SOC）治疗效果的评估能力。实验中，先将接种 MCF-7 细胞（5×10⁵ 个 /mL）的 SPE 孵育 24 h，然后用含不同浓度 PTX（1 nM、5 nM 和 50 nM）的培养基处理 24 h，再进行电化学测量。EIS 分析显示，随着 PTX 浓度增加，阻抗降低，这是因为 PTX 的细胞毒性使细胞数量减少，电极表面可用于电化学反应的面积增大；CV 和 DPV 分析表明，峰电流信号随 PTX 浓度增加而升高，这是由于细胞覆盖减少，电活性物质更易到达电极表面，电荷转移电阻降低。结果表明该平台可用于评估 SOC 药物对癌细胞的抗肿瘤效果 。

本研究成功开发了集成培养箱的电化学分析平台，有效解决了传统电化学细胞研究中实验环境与细胞体内环境差异大的问题，在细胞研究领域取得重要突破。该平台实现了从细胞培养到分析的无缝过渡，能在维持细胞生理条件的同时，精确控制培养和测量环境，确保了实验结果的准确性和可靠性。通过一系列实验，充分验证了平台在区分不同细胞密度、监测细胞增殖动态以及评估药物疗效方面的卓越能力。在药物筛选和个性化医学领域，该平台展现出巨大的应用潜力，有助于更高效地筛选新型药物，为患者提供更精准的治疗方案。未来，随着技术的不断完善和拓展，有望进一步推动细胞分析和治疗研究的发展，为生物医学领域带来更多创新成果，对攻克复杂疾病、提升人类健康水平具有重要意义。

这项研究成果为细胞研究提供了一种先进、可靠的技术平台，其创新的设计理念和卓越的性能，为相关领域的研究开辟了新的道路，值得科研人员深入关注和进一步探索应用。