靶向 GPN3：非小细胞肺癌治疗新曙光 —— 南昌大学第一附属医院科研成果解读

南昌大学第一附属医院的科研团队在《Cell Death Discovery》期刊发表了题为 “GTPase GPN3 facilitates cell proliferation and migration in non - small cell lung cancer by impeding clathrin - mediated endocytosis of EGFR” 的研究论文。这一成果为深入理解非小细胞肺癌（NSCLC）的发病机制及开发新型治疗策略提供了关键线索，在肿瘤研究领域具有重要意义。

论文摘要指出，小 GTP 酶在细胞信号转导和多种细胞过程中至关重要，与人类疾病尤其是癌症的发生发展密切相关。GPN3 作为 GPN - loop GTP 酶亚家族成员，其细胞功能和分子机制此前尚不明确。该研究发现，GPN3 与网格蛋白轻链 A（CLTA）、AP2B1 和 AP2S1 相互作用，抑制网格蛋白包被小窝的内陷。同时，GPN3 与表皮生长因子受体（EGFR）相互作用，调节 EGFR 与 CLTA 的共定位以及 EGFR 在早期内体中的定位，减少 EGFR 的内吞水平，增加其在细胞膜表面的积累，延长 EGFR 信号通路的激活。功能实验表明，GPN3 的作用依赖于细胞内 GTP 的丰度。研究还发现，NSCLC 组织中 GPN3 异常过表达，且高表达与患者预后不良相关。这一系列发现揭示了 GPN3 通过调节网格蛋白依赖的 EGFR 内吞作用促进 NSCLC 细胞增殖和迁移，提示 GPN3 可作为 NSCLC 预后的生物标志物和潜在治疗靶点。

肺癌是全球范围内常见且致死率极高的恶性肿瘤，NSCLC 占肺癌病例的 85%，主要包括肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）。尽管目前有手术、放化疗、免疫治疗和靶向治疗等手段，但患者生存率仍不理想，主要原因是早期转移、放化疗耐药及免疫原性异质性。因此，深入探索 NSCLC 进展的分子机制，开发新型治疗策略迫在眉睫。

表皮生长因子受体（EGFR）在肿瘤发生中起着关键作用，其异常表达和细胞内运输失调与 NSCLC 的发生发展密切相关。EGFR 通常通过网格蛋白依赖的内吞作用进入细胞，这一过程是其信号通路的负反馈调节机制。当 EGFR 内吞运输失调时，会导致 EGFR 信号通路持续激活，促进癌症发生。小 GTP 酶参与多种细胞过程，GPN3 作为 GPN - loop GTP 酶亚家族成员，虽已知其在 RNA 聚合酶 II 生物合成和核转运中起作用，但在肿瘤中的作用及分子机制仍不清楚。基于此，研究人员推测 GPN3 可能参与调节内吞介导的蛋白质运输，进而影响肿瘤进展，这成为本研究的重要出发点。

在材料选择上，研究使用多种细胞系，包括人非小细胞肺癌细胞系 A549、NCI - H1299、PC9 以及人胚胎肾细胞系 HEK - 293T，还获取了人源 NSCLC 组织和相邻正常组织用于实验研究。实验中使用了多种抗体，如 Cell Signaling Technology、Proteintech、BD Biosciences 等公司提供的针对 EGFR、ERK1/2、GPN3 等蛋白的抗体，以及构建多种表达质粒，如用于 GPN3 过表达的质粒、表达 GST - GPN3 的质粒等，为后续实验提供了关键工具。

在实验技术方面，运用 GST - pull down 和免疫共沉淀（co - IP）技术检测蛋白质之间的相互作用；通过蛋白质免疫印迹（immunoblotting assay）对蛋白质进行定性和定量分析；利用透射电子显微镜（TEM）观察网格蛋白包被小窝（CCPs）的内陷情况；采用细胞表面生物素化和内化实验测定细胞表面和内吞的 EGFR 水平；借助免疫荧光实验探究蛋白质的共定位和定位情况；运用慢病毒表达系统构建稳定过表达或敲低 GPN3 的细胞模型；利用 CCK8、EdU 掺入、平板克隆形成和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖能力，通过 Transwell 实验检测细胞迁移能力；构建皮下异种移植瘤模型研究 GPN3 在体内对肿瘤生长的影响；使用免疫组织化学（IHC）分析 GPN3 在组织中的表达情况。

在技术路线上，首先通过 LC - MS/MS 分析和富集分析确定 GPN3 潜在的相互作用蛋白，探索其参与的生物学过程。接着验证 GPN3 与 CLTA、AP2B1 等蛋白的相互作用，以及对 CCPs 内陷的影响，以确定其对网格蛋白介导的内吞作用的调控。然后研究 GPN3 对 EGFR 内吞运输的影响，包括 EGFR 与 CLTA 的共定位、EGFR 在早期内体中的定位、细胞表面和内吞 EGFR 水平的变化。之后探究 GPN3 对 EGFR 信号通路激活的影响，以及细胞内 GTP 丰度对 GPN3 功能的作用。最后，通过体内外实验研究 GPN3 对 NSCLC 细胞增殖和迁移的影响，以及分析 GPN3 表达与 NSCLC 患者预后的关系。

研究人员对 GPN3 免疫沉淀产物进行 LC - MS/MS 分析和通路富集分析，发现其潜在相互作用蛋白参与翻译、mRNA 稳定性调节等过程，还涉及囊泡介导的运输和细胞内蛋白质运输等。通过 GST - pull down 实验证实 GPN3 与 CLTA、AP2B1 和 AP2S1 相互作用，且过表达 GPN3 抑制 EGF 刺激下 CCPs 的形成，表明 GPN3 可能通过调节网格蛋白介导的内吞作用影响膜受体信号转导。

免疫荧光实验显示，过表达 GPN3 抑制 EGF 刺激后 EGFR 与 CLTA 的共定位。免疫共沉淀实验证实 EGFR 与 GPN3 相互作用，且该作用在 EGF 刺激后增强，内源性蛋白免疫沉淀实验也验证了这一相互作用。此外，过表达 GPN3 抑制 EGFR 在早期内体的定位，增加其在细胞膜的定位，减少内吞的 EGFR 水平，说明 GPN3 限制 EGFR 进入网格蛋白包被小窝，抑制其通过网格蛋白介导的内吞作用进行运输。

研究发现过表达 GPN3 延长 EGFR 磷酸化和下游 ERK1/2 激活的时间。使用霉酚酸（MPA）耗尽细胞内 GTP 后，GPN3 与 EGFR 的相互作用减弱，由 GPN3 过表达介导的 EGFR 信号通路激活增强也被逆转，表明 GPN3 促进 EGFR 信号通路激活依赖于细胞内 GTP 丰度，GPN3 的功能可能需要与 GTP 结合的活性状态。

研究人员构建稳定敲低 GPN3 的 NCI - H1299 和 PC9 细胞系，EdU 掺入实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验表明，敲低 GPN3 抑制 NCI - H1299 细胞的增殖能力；Transwell 实验显示敲低 GPN3 的细胞迁移能力下降。在 PC9 细胞中也得到类似结果，说明 GPN3 参与 NSCLC 的进展，调节癌细胞的恶性特性。

研究人员构建稳定过表达 GPN3 的 NCI - H1299 和 A549 细胞系，平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验表明，过表达 GPN3 促进 NCI - H1299 和 A549 细胞的增殖；Transwell 实验显示过表达 GPN3 的细胞迁移能力增强。在 EGF 刺激下，GPN3 过表达进一步促进 NCI - H1299 细胞的增殖和迁移，并增强 EGFR 信号通路的激活。体内实验中，将过表达 GPN3 的 A549 细胞接种到裸鼠皮下，发现过表达 GPN3 显著促进肿瘤生长，且肿瘤组织中细胞增殖标记物 Ki67 和迁移关键调节因子 MMP9 表达上调，表明 GPN3 在体内外均能促进 NSCLC 细胞的增殖和迁移。

通过 UALCAN 分析平台对 TCGA 数据库进行分析，发现 LUAD 和 LUSC 组织中 GPN3 表达高于正常组织，且 NSCLC 分期越高，GPN3 表达越高。蛋白质免疫印迹实验和 IHC 实验在临床组织样本中也证实了这一结果。临床病理相关性分析显示，GPN3 高表达与 NSCLC 的远处转移和组织学分级相关。GEPIA2 和 Kaplan - Meier Plotter 分析表明，GPN3 高表达与 LUAD 和 LUSC 患者的不良预后相关，单因素分析也显示 GPN3 高表达与 NSCLC 患者无病生存期和总生存期缩短相关，说明 GPN3 高表达促进 NSCLC 的进展。

研究表明，GPN3 在 NSCLC 中发挥癌基因的作用。NSCLC 组织中 GPN3 表达高于相邻正常组织，高表达与患者预后不良相关。下调 GPN3 抑制 NSCLC 细胞增殖和迁移，而过表达则促进细胞增殖和迁移，提示 GPN3 可作为 NSCLC 潜在的诊断和预后生物标志物，也是潜在的治疗靶点，但 GPN3 在其他肿瘤类型和非肿瘤疾病中的作用仍需进一步研究。

GPN3 参与调节囊泡运输和蛋白质运输过程。过表达 GPN3 抑制 CCPs 内陷和 EGF 刺激下 EGFR 在网格蛋白相关亚细胞结构及早期内体的定位，使 EGFR 在细胞膜表面积累，延长 EGFR 信号通路激活，表明 GPN3 参与了细胞内重要的运输过程。此外，基于 GPN3 潜在相互作用蛋白的富集分析，推测 GPN3 可能还参与调节中性粒细胞脱颗粒影响肿瘤微环境、通过 VEGFA - VEGFR2 信号调节肿瘤血管生成以及参与肿瘤代谢重编程等过程，但这些仍需进一步实验验证。

细胞内 GTP 丰度对 GPN3 的功能至关重要。多数 GTP 酶通过与 GTP 或 GDP 结合的状态转换发挥功能，GPN3 作为 GPN - loop GTP 酶亚家族成员，虽内在 GTP 酶活性较弱，但本研究发现耗尽 GTP 会减弱 GPN3 与 EGFR 的相互作用，抑制由 GPN3 过表达介导的 EGFR 信号通路激活，说明 GPN3 与 GTP 结合的状态对其发挥功能至关重要。

该研究首次全面揭示了 GPN3 在 NSCLC 中的重要作用及分子机制。从细胞内分子相互作用，到细胞增殖、迁移等功能改变，再到与患者临床预后的关联，为 NSCLC 的研究提供了全新的视角。确定 GPN3 为潜在的生物标志物和治疗靶点，有望推动 NSCLC 诊断和治疗技术的发展，例如开发针对 GPN3 的靶向药物，或通过检测 GPN3 表达水平为临床治疗方案的选择提供依据，对改善 NSCLC 患者的预后具有重要的理论和实践意义，也为后续肿瘤研究指明了新方向。