CLEM-Reg：基于点云自动配准算法实现体积关联光电子显微技术的突破

体积关联光电显微（vCLEM）技术面临配准过程繁琐且主观性强的问题。本研究开发了CLEM-Reg算法，通过概率点云配准技术，利用开源方法分割线粒体等共有结构生成点云，实现三维自动配准。该算法将配准时间缩短至数分钟，并在三个新采集的基准数据集中实现了荧光信号与亚微米目标结构的精准关联，为细胞器功能研究提供了高效可靠的解决方案。

在生命科学研究中，科学家们一直致力于观察细胞内部精细结构的动态变化过程。体积关联光电子显微镜（volume correlative light and electron microscopy, vCLEM）技术应运而生，它巧妙地将荧光显微镜（fluorescence microscopy, FM）的分子特异性与电子显微镜（electron microscopy, EM）的高分辨率优势相结合，成为研究稀有生物事件和动态过程的重要工具。然而，这项技术面临着一个长期存在的技术瓶颈：由于两种成像模式在分辨率、对比度和视野范围方面存在显著差异，传统的基于图像强度的配准方法难以直接应用，研究人员不得不依赖耗时且主观的手动标记方法进行图像配准，这严重限制了技术的通量和客观性。

目前vCLEM配准主要存在两大挑战。首先是技术层面的困难：FM图像受到衍射极限的限制，分辨率通常不超过200纳米，而EM图像虽然能够达到纳米级分辨率，但缺乏分子特异性。两种成像模式之间的线性与非线性的样本变形更加剧了配准的复杂性。其次是方法学的局限：现有的半自动或基于深度学习的方法要么局限于二维配准，要么需要大量已配准的训练数据，而这在vCLEM领域极为稀缺。

为了解决这些难题，由Daniel Krentzel、Matous Elphick等研究人员组成的国际团队在《Nature Methods》上发表了他们的研究成果。他们开发了名为CLEM-Reg的全自动配准算法，通过创新的点云配准方法，实现了vCLEM数据集的快速、准确且客观的三维配准。

研究人员采用了几项关键技术方法：使用三维拉普拉斯高斯（Laplacian of Gaussian, LoG）滤波和动态阈值法分割荧光显微镜中的线粒体；应用预训练的MitoNet深度学习模型处理电子显微镜数据；通过点云采样和相干点漂移（coherent point drift, CPD）算法实现模态无关的配准；并开发了napari插件实现端到端的操作流程。研究使用了三组新采集的HeLa细胞vCLEM基准数据集（EMPIAR-10819、EMPIAR-11537和EMPIAR-11666），分别通过FIB-SEM和SBF-SEM技术获取。

Benchmark dataset acquisition

研究人员获得了三组人宫颈癌上皮细胞（HeLa）的vCLEM基准数据集，分别标记了线粒体（MitoTracker Deep Red）、细胞核（Hoechst 33342）、高尔基体蛋白TGN46（GFP-TGN46）和溶酶体（LysoTracker red）等结构。通过Zeiss Airyscan LSM900显微镜进行FM成像后，使用FIB-SEM获取各向同性体素大小为5纳米的EM体积，而SBF-SEM数据集则具有7纳米xy分辨率和50纳米z分辨率。

The CLEM-Reg pipeline

CLEM-Reg通过分割FM和EM中的线粒体，生成点云并使用CPD算法进行配准，最终将FM体积变换到EM空间。该算法以napari插件形式实现，支持一键式端到端操作，也允许用户调整或替换单个工作流程步骤。

Segmenting internal landmarks

研究选择线粒体作为内部标志物，因其在细胞中分布广泛且在两种模态中都易于成像。FM中的分割采用3D LoG滤波结合动态阈值法处理信号衰减，而EM分割使用MitoNet模型，该模型在FIB-SEM数据上表现良好，对SBF-SEM数据需要轻微预处理。

Generating modality-agnostic point clouds and registration

从分割掩模中采样3D点云大大降低了计算负荷，并通过概率配准算法忽略分割错误。点云采样密度和体素大小参数可调节以平衡配准速度与精度。配准算法支持刚性CPD、仿射CPD或非线性贝叶斯CPD（BCPD），根据预期变形和计算约束选择。

Warping FM volume to obtain vCLEM overlay

点云配准后，使用获得的变换矩阵将FM体积映射到EM体积。刚性变换速度快，而非线性变换速度慢两个数量级。CLEM-Reg实现了3D薄板样条变换进行非线性扭曲。

性能评估与比较

研究人员通过量化荧光信号（LysoTracker）与亚微米目标结构（溶酶体）的相关性来评估配准性能。在FIB-SEM数据集上，CLEM-Reg仅需2.17分钟即可获得所有通道的叠加图像，而使用BigWarp手动配准则需要约2小时。溶酶体体积比CLEM-Reg获得的质心距离平均大14.95倍，表明荧光信号与溶酶体之间存在明确相关性。

在SBF-SEM数据集上，CLEM-Reg仅需2.44分钟（包括线粒体分割和图像扭曲），而手动配准需要约2小时。溶酶体平均比CLEM-Reg获得的质心距离大6.95倍。值得注意的是，CLEM-Reg在两个溶酶体上获得了比手动配准更小的质心距离。

CLEM-Reg plugin for napari

研究人员开发了napari-clemreg插件，允许用户通过单按钮点击自动注册vCLEM数据集。该插件包含执行和显示完整管道中间步骤的选项，支持参数调整和结果微调，可直接导出叠加图像和变换后的点云用于质量控制。

Identifying TGN46-positive transport carriers with CLEM-Reg

通过使用脱靶标志物（线粒体）推导变换矩阵，CLEM-Reg实现了荧光与小目标细胞器的精确叠加，同时最小化了直接将荧光与假定目标结构对齐带来的主观误差。研究发现，TGN46阳性的CARTS在不同细胞位置存在不同的形态群体：小的囊泡结构倾向于定位在外周，而复杂的膜和囊泡结构更靠近核周区域。

研究结论表明，CLEM-Reg成功实现了FIB-SEM和SBF-SEM数据的vCLEM自动配准，以接近专家水平的准确性关联亚微米结构，同时显著减少了配准时间。荧光目标结构的叠加与分割脱靶结构（线粒体）的距离不相关，且CLEM-Reg的配准效果与BigWarp相当，前提是手动标记的放置误差不超过5个像素。

重要的是，CLEM-Reg使用脱靶通道（MitoTracker）进行配准，并在未见过的目标通道（LysoTracker）上评估性能，减少了直接对齐目标结构可能产生的偏差。该技术的成功开发不仅解决了vCLEM领域的核心技术瓶颈，还为研究亚微米细胞器的功能提供了强有力的工具，有望在细胞生物学和疾病机制研究中发挥重要作用。

讨论部分指出，虽然非线性配准通常被认为能提供更好的对齐性能，但本研究结果表明刚性配准在FIB-SEM基准数据集上表现更优，且运行速度快两个数量级。这可能是因为点云数据本身存在噪声，非线性方法更容易收敛到非最优解。随着基于人工智能的分割方法的快速发展，适合的目标结构范围可能会继续扩大，这些发展有望将CLEM-Reg的适用性扩展到vCLEM之外的其他多模态配准任务中。