KLHL6驱动CD8+T细胞抗耗竭与线粒体功能维持的机制
整合T细胞耗竭图谱与线粒体功能图谱的计算分析，结合体内CRISPR筛选，发现KLHL6作为E3泛素连接酶可同时负向调控T细胞耗竭分化和线粒体功能障碍。机制上，KLHL6通过促进TOX的K48连接多聚泛素化及蛋白酶体降解，延缓祖细胞耗竭T细胞（Tpex）向终末耗竭T细胞（Texterm）的转化；同时通过调控PGAM5–Drp1轴抑制线粒体过度分裂，维持线粒体健康。然而，T细胞受体（TCR）持续激活会下调KLHL6表达，削弱其有益作用。在B16-OVA黑色素瘤模型和LCMV慢性感染模型中，强制表达KLHL6可显著提升T细胞抗肿瘤效果及长期存活率。
CRISPR筛选鉴定E3连接酶调控T细胞功能
通过分析136个CD8+T细胞RNA测序样本，构建T细胞耗竭转录组图谱，提炼出两个核心基因模块：模块1关联慢性刺激与耗竭分化，模块2关联增殖与祖细胞耗竭特征。泛素-蛋白酶体系统（UPS）通路在模块中显著富集。体内CRISPR筛选显示，KLHL6缺失会增加PD-1+TIM-3+耗竭T细胞比例和线粒体去极化频率，而KLHL6过表达（OE）则相反。验证实验证实KLHL6缺失导致T细胞抗肿瘤功能下降，线粒体膜电位降低，凋亡增加。
KLHL6缺陷损害T细胞功能
在B16-OVA模型中，KLHL6缺陷型（KO）OT-I T细胞肿瘤浸润数量减少，耗竭标志物（PD-1、TIM-3、LAG-3、TOX）表达升高，细胞因子（TNF、IFNγ）分泌下降。转录组分析显示KO细胞中耗竭相关基因上调，记忆/干细胞相关基因下调。KLHL6-OE T细胞则表现出增强的线粒体呼吸容量（SRC）、ATP产量及线粒体膜电位，并富集Tpex细胞亚群。在慢性LCMV感染模型中，KLHL6缺失同样加剧T细胞耗竭和病毒控制失败。
KLHL6介导TOX泛素化降解
E3-底物泛素生物素化标记联合质谱分析鉴定TOX为KLHL6直接底物。KLHL6与TOX羧基端结构域结合，促进其K48连接多聚泛素化及降解。TOX中4个保守赖氨酸位点（K245/K246/K248/K323）突变可抵抗KLHL6介导的降解。在T细胞中，KLHL6-OE降低TOX蛋白水平，而KLHL6缺失或TCR持续刺激会升高TOX表达，促进耗竭程序。
KLHL6–PGAM5轴维持T细胞线粒体健康
KLHL6缺失导致线粒体形态碎片化，融合蛋白（Mfn2、Opa1）下降，分裂蛋白Drp1活性升高。PGAM5作为KLHL6另一底物，其缺失可逆转KLHL6-KO引起的线粒体功能障碍。KLHL6通过降解PGAM5抑制Drp1去磷酸化，从而维持线粒体动力学平衡。在体内，PGAM5敲低或抑制剂处理可部分恢复KLHL6-KO T细胞的抗肿瘤功能。过表达线粒体生物发生调控因子PGC1α也能改善KLHL6-KO细胞的代谢缺陷。
双重靶向增强抗肿瘤免疫
同时敲低TOX和PGAM5在KLHL6缺陷T细胞中产生叠加效应，显著提升肿瘤控制能力和T细胞持久性。值得注意的是，TOX过表达并不直接影响线粒体功能，表明KLHL6通过独立通路调控耗竭分化和线粒体稳态。临床数据分析显示，KLHL6低表达与T细胞耗竭正相关，提示其作为癌症免疫治疗潜在靶点的临床转化价值。
总结
KLHL6通过泛素化降解TOX和调控PGAM5–Drp1轴，双重抑制T细胞耗竭进程并维持线粒体功能，为改善过继性T细胞疗法提供了新策略。靶向KLHL6或其下游通路可能突破当前肿瘤免疫治疗的瓶颈。
