Development of GPCR biosensors
G蛋白偶联受体（GPCR）是细胞通信的核心介质，也是最重要的药物靶点类别。尽管既往研究利用纯化受体在体外证实GPCR存在多种失活与激活状态的动态平衡，且配体可依赖其效能（efficacy）调控该平衡，但配体效能如何在活细胞中编码、以及是否存在多重受体状态仍不明确。本研究通过遗传密码子扩展（genetic code expansion）和生物正交标记（bioorthogonal labelling）技术，针对原型GPCR——M2毒蕈碱乙酰胆碱受体（M2R）开发了一组荧光生物传感器。这些传感器可在完整细胞中实时监测激动剂促进的受体胞外域构象变化。
研究团队在M2R胞外区系统筛选了72个位点，最终获得7个具有良好细胞膜表达及标记效率的传感器位点（如Thr84、Glu175、Phe181等）。通过将非经典氨基酸TCO*K（trans-cyclooct-2-ene lysine）定点插入受体，并利用四嗪-花菁染料（Tet–Cy3）进行快速生物正交标记，实现了对单个氨基酸位点的高时空分辨率监测。所有传感器均保留完整的G蛋白偶联功能，且其荧光变化源于局部微环境变化（如疏水性/极性转变），反映了受体激活相关的构象重排。
Ligand-unique conformational states of the M2R
研究比较了不同效能激动剂（包括完全激动剂ACh、超激动剂iperoxo、部分激动剂arecoline和pilocarpine）激活M2R时的构象响应。结果显示，不同激动剂诱导的荧光变化幅度和方向存在显著差异：iperoxo在多数位点（如M2R84、M2R175）引发比ACh更强的响应，而arecoline和pilocarpine则呈现部分激活特征。通过雷达图可视化各激动剂的“构象指纹”，发现不同配体稳定了独特的受体活性状态组合，且这些状态的分布与激动剂效能相关。例如，高效能激动剂倾向于诱导M2R175和M2R415位点的快速构象变化（对应高效信号复合物C1），而低效能激动剂pilocarpine则显著促进M2R181和M2R188位点的慢速响应（对应低效复合物C2）。
Distinct receptor–G-protein complexes
为探究G蛋白偶联对受体构象的影响，研究过表达了核苷酸亲和力降低的突变G蛋白亚基GαoA(G203T)，以稳定受体-G蛋白复合物。结果显示，GαoA(G203T)过表达可选择性地调控不同传感器位点的响应：例如，在M2R175和M2R415位点，所有激动剂引发的荧光变化均被抑制，提示这些位点指示高效信号复合物（C1）的形成；而在M2R181和M2R188位点，G蛋白过表达反而增强响应，表明这些位点对应低效复合物（C2）。此外，百日咳毒素（PTX）预处理实验进一步证实，Gi/o蛋白的失活可消除C2相关信号，支持C2为GDP结合的低效复合物。
Kinetics of the formation and dynamics of M2R–G-protein complexes
动力学分析揭示了配体特异的激活轨迹。高效激动剂（ACh、iperoxo）首先在数百毫秒内诱导C1形成，随后在数秒内形成C2；而部分激动剂arecoline则通过独特路径优先稳定中间态C3和C4。值得注意的是，iperoxo几乎不诱导C2形成，而pilocarpine强烈偏向C2，arecoline则表现出对Go蛋白亚型的偏好性激活。这些时间分辨的构象变化表明，不同激动剂通过差异化的激活轨迹调控受体-G蛋白复合物的形成时序与稳态分布。
Equilibria of complexes define ligand efficacy
通过TRUPATH平台评估M2R对14种G蛋白的激活偏好，发现所有激动剂均主要激活Gi/o家族，但其效能谱存在显著差异：iperoxo对多数G蛋白表现为超激动剂；arecoline对GoA/GoB显示超激动活性，但对其他Gi/o成员为部分激动剂；pilocarpine则普遍为部分激动剂。这种效能差异与构象平衡的位置密切相关——C1/C2的比例决定了整体激动强度，而激活轨迹的差异则调控G蛋白亚型选择性。
Conclusions
本研究通过高时空分辨率的活细胞构象监测，揭示了GPCR激活的复杂性与配体特异性。激动剂不仅调控受体活性状态的稳态分布，还通过独特的构象变化轨迹影响信号复合物的形成时序与组成。这些发现阐明了配体效能的分子基础，并为开发靶向特定GPCR激活路径的药物提供了新策略。
