基于高维蛋白质分析揭示胰腺导管腺癌原发灶与肝转移灶在免疫和基质特征上的显著差异

为探索胰腺导管腺癌（PDAC）患者预后不佳的免疫学原因，研究者假设其原发灶与转移灶的免疫微环境存在差异。本研究利用多重免疫组化、空间分析和单细胞质谱流式技术，对27例原发和26例肝转移PDAC肿瘤进行分析。结果发现，与原发性肿瘤相比，转移灶T细胞浸润、成纤维细胞数量和胶原积累减少，而CD68+（常共表达CCR2）细胞增多，空间结构亦迥异。CyTOF分析进一步显示T细胞高表达LAG3、PD-1等多种抑制性检查点受体。这项工作在蛋白层面揭示了两者间巨大的免疫和基质特征差异，为靶向巨噬细胞、增加转移灶T细胞丰度的免疫疗法提供了理论依据。

胰腺癌，尤其是胰腺导管腺癌（PDAC），是一种预后极差的恶性肿瘤，五年生存率仅为13%。大多数患者在确诊时已发生转移，其中肝转移尤为常见。尽管免疫疗法已在多种癌症中展现出潜力，但在PDAC中却收效甚微。这背后一个重要的认知缺口在于：当前我们对PDAC免疫特征的理解，主要建立在对其原发灶的研究之上，而对构成患者主要死因的转移灶，特别是肝转移灶的免疫和基质微环境，却知之甚少。肝脏本身就是一个免疫豁免器官，那么转移至此的PDAC细胞，其周围的“生态”是否会发生变化？这些变化是否导致了免疫疗法的失效？为了填补这一知识空白，并为晚期PDAC患者找到更有效的免疫治疗策略，一个国际研究团队在《Cancer Research》上发表了他们的最新成果。

为了解答上述问题，研究团队设计了一套多组学、高分辨率的分析方案。他们从27名接受Whipple手术的PDAC患者和26名参加临床试验的不可切除肝转移PDAC患者中，分别获取了原发肿瘤和肝转移灶的穿刺活检新鲜组织。研究人员综合运用了多重免疫组化（mIHC）、多重免疫荧光（mIF）、天狼星红染色、单细胞空间分析以及单细胞质谱流式（CyTOF）等高通量蛋白质分析技术，从细胞组成、空间分布、蛋白表达等多个维度，系统比较了原发与转移PDAC的免疫及基质特征。

研究结果

原发性与转移性PDAC具有不同的细胞组成

研究者首先通过mIHC对肿瘤样本进行全景式扫描。结果发现，肝转移灶的免疫图谱与原发灶截然不同。最显著的差异之一是T细胞的极度匮乏：与原发灶相比，转移灶中CD3⁺T细胞，尤其是CD8⁺细胞毒性T细胞的浸润显著减少。然而，转移灶并非“免疫荒漠”，其中CD68⁺巨噬细胞的比例反而显著升高。此外，作为PDAC标志性特征的致密纤维间质（desmoplastic stroma）在转移灶中也发生了改变：αSMA⁺的癌症相关成纤维细胞（CAF）和胶原沉积均比原发灶更少。对CAF的进一步分型显示，在两类肿瘤中，具有收缩表型的肌成纤维细胞样CAF（myCAF）都占主导，但炎症性CAF（iCAF）和myCAF的比例在转移灶中更高。这些数据从细胞丰度层面证实了原发与转移PDAC微环境的根本性差异。

成纤维细胞和巨噬细胞群在原发与转移性PDAC中存在异质性

为了深入表征基质特征，天狼星红染色定量证实转移灶的胶原纤维含量确实更低。通过mIF对CAF标记物（αSMA、PDGFRβ、PDPLN）的分析发现，虽然CAF亚群比例在两地无显著差异，但表达PDGFRβ的成纤维细胞在转移灶中有增多趋势，而表达PDPLN的则在原发灶中更丰富。对巨噬细胞的深入剖析（标记物：CD68、CCR2、CD163）揭示，转移灶中富集的CD68⁺巨噬细胞，有相当一部分共表达趋化因子受体CCR2；而原发灶中则含有更高比例的CD163⁺巨噬细胞（通常与M2样抗炎表型相关）。这提示，两地巨噬细胞的募集机制和功能状态可能存在差异。

CK19⁺细胞周围的免疫细胞分布和邻近性在原发与转移性PDAC中存在差异

细胞不仅数量有异，其空间排布也蕴藏重要信息。通过分析mIHC数据中的细胞坐标，研究者绘制了肿瘤的“社交网络图”。他们发现，围绕肿瘤细胞（CK19⁺）的“邻里关系”在两地大不相同。在原发灶中，CK19⁺细胞与αSMA⁺成纤维细胞、CD3⁺T细胞和CD68⁺巨噬细胞形成一个紧密的社区。而在转移灶中，CK19⁺细胞则与αSMA⁺IL6⁺、CD3⁺IL6⁺、CD19⁺IL6⁻和CD68⁺IL6⁻细胞聚集在一起。对肿瘤结构区域（如瘤内、内缘、外缘、基质）的分析进一步显示，CD3⁺T细胞在两地都主要分布于基质和外缘，难以深入肿瘤核心；而CD68⁺巨噬细胞则在肿瘤内部和边缘区域都更丰富。这些空间格局的差异，可能直接影响免疫细胞与癌细胞的相互作用效能。

来自原发性PDAC肿瘤的T细胞表达FoxP3和RORγt

对T细胞亚群和功能状态的精细分析带来了更多发现。mIHC证实，原发灶中的CD4⁺T细胞比转移灶中的同类细胞，更高比例地表达了转录因子FoxP3（调节性T细胞Treg的关键标志）和RORγt（与Th17细胞相关）。这两种细胞通常被认为具有免疫抑制或促炎/促肿瘤特性。而在转移灶的CD4⁺T细胞中，倾向于促炎的T-bet（Th1相关）表达有升高趋势。尽管CD8⁺T细胞总体稀少，但在两地均以表达T-bet为主。这些数据表明，残存于肿瘤（尤其是原发灶）中的T细胞，其功能状态很可能是受抑制或失调的。

CyTOF分析揭示了原发性和肝转移性PDAC中淋巴细胞群的免疫调节特征

为了在单细胞水平进行更深入的免疫表型分析，研究者对12例原发灶和23例转移灶的新鲜组织消化液进行了质谱流式分析。结果验证了组织学发现，并提供了更高维度的信息。虽然样本间异质性很大，但平均而言，转移灶中的CD8⁺T细胞和CD19⁺B细胞有比原发灶更多的趋势，且这些细胞中表达增殖标记Ki67的比例更高。对B细胞的分析显示，转移灶中具有调节潜能的B细胞（表达PD-1和/或PD-L1）比例有升高趋势。

T细胞在不同疾病部位均表达抑制性免疫检查点受体

研究最后聚焦于T细胞上的免疫检查点，这是当前免疫治疗的主要靶标。质谱流式分析显示，无论是原发灶还是转移灶的CD4⁺和CD8⁺T细胞，都共同表达了多种抑制性受体，呈现“共抑制”状态。其中，CTLA4、LAG3和PD-1在CD4⁺T细胞上表达最为丰富。对五种关键检查点（CTLA4、LAG3、PD-1、TIGIT、TIM3）的共表达模式进行布尔分析发现，在原发灶CD4⁺T细胞中，CTLA4、LAG3、PD-1三阳性，以及CTLA4、LAG3、PD-1、TIGIT四阳性的组合占主导；在转移灶中也以类似组合为主。在CD8⁺T细胞上，原发灶以LAG3、PD-1双阳性及CTLA4、PD-1、TIGIT三阳性组合常见，而转移灶则以CTLA4、PD-1、TIGIT三阳性及PD-1、TIGIT双阳性组合为主。这些复杂的共表达模式提示，针对单一检查点的阻断疗法在PDAC中可能效果有限，联合阻断策略或更具前景。

研究结论与意义

这项研究通过高维度的蛋白组学分析，首次在系统水平上描绘并比较了人类PDAC原发灶与肝转移灶的免疫和基质微环境全景图。研究得出的核心结论是：两者之间存在“巨大而显著的差异”，这并非量的增减，而是质的改变。

从细胞构成上看，肝转移灶是一个“贫T细胞、富巨噬细胞、少基质”的独特生态。其免疫抑制环境可能更多地由CCR2⁺巨噬细胞主导，而非原发灶中丰富的Treg、致密基质和CD163⁺巨噬细胞。从空间结构看，癌细胞与周围免疫细胞、基质细胞的“邻里关系”在两地也重新洗牌，形成了不同的细胞社群，这必然影响细胞间的通讯与功能。从T细胞状态看，残存的T细胞普遍高表达包括LAG3、PD-1在内的多种抑制性检查点，处于深度耗竭或抑制状态。

这项研究的重大意义在于，它强烈地质疑了将基于原发性PDAC研究得出的免疫治疗策略，直接应用于晚期转移患者的传统做法。研究指出，未来的免疫治疗开发必须具有“位点特异性”：对于肝转移为主的晚期PDAC，策略可能需要从“增加T细胞浸润”转向“靶向巨噬细胞”（如CCR2拮抗剂）和“解除T细胞多重抑制”（如LAG3/PD-1联合阻断）。这些基于患者组织真实世界数据的发现，为设计下一阶段针对转移性PDAC的精准免疫临床试验提供了坚实、全新的理论依据和靶点线索。