引言
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种非致病性的土壤放线菌，自20世纪60年代以来一直被用于氨基酸（如L-谷氨酸和L-赖氨酸）的工业化生产。由于其工业相关性和在大规模发酵中已证实的鲁棒性，C. glutamicum已成为生物技术领域深入研究的模式微生物。除了小分子生产，C. glutamicum作为重组蛋白生产和分泌的宿主也日益受到关注。与大肠杆菌（Escherichia coli）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等宿主相比，C. glutamicum既不产生内毒素，也不表现出显著的胞外蛋白酶活性，这在食品和生物制药领域具有重要优势。
C. glutamicum拥有通用的分泌（Sec）途径和双精氨酸转运（Tat）途径，用于将蛋白质转运穿过细胞质膜。将异源蛋白分泌到培养上清液中具有若干优点，最显著的是简化了下游加工过程并显著降低了产品回收的成本。开发异源蛋白分泌生产工艺的关键步骤是确定一个合适的信号肽，该信号肽能将蛋白质导向细胞质膜中的Sec或Tat转运系统。大量研究表明，不存在对所有蛋白质都通用的高效SP；相反，必须通过系统筛选为每个目标蛋白单独确定最佳SP。此外，给定蛋白质的最佳SP可能因细菌宿主而异。因此，SP筛选是增强异源蛋白分泌的一种强大而高效的策略。
材料与方法
为了简化C. glutamicum中的SP筛选并利用其天然库，本研究建立了一种模块化克隆策略，结合新近建立的AutoBioTech高通量自动化平台，用于快速鉴定所选目标蛋白的最佳SP。MoClo是一种基于Golden Gate克隆的标准化DNA组装框架，能够将具有预定义粘性末端的可重复使用的遗传部分分层组合成多基因构建体。该系统的模块化特性，包含启动子、核糖体结合位点、SP和目标蛋白等元件，有助于对特定感兴趣模块进行系统评估和随机筛选。
研究人员为标准菌株C. glutamicum ATCC 13032构建了一个MoClo兼容的SP库，并设计了用于在C. glutamicum中直接进行分泌筛选的转录单元载体。使用角质酶作为主要模型蛋白，因为它已被广泛用于研究该菌株中的蛋白质分泌。通过两种互补方法检测分泌的蛋白质：角质酶酶活性测定和split GFP测定。在split GFP测定中，目标蛋白在其C末端与GFP11 报告标签融合，并与GFP1-10 检测蛋白孵育后发出荧光信号。
模块化C. glutamicum Sec依赖性信号肽库
本研究基于CIDAR MoClo工具包构建了模块化的C. glutamicum SP库。创建了一个专用的水平1穿梭（大肠杆菌/C. glutamicum）转录单元载体（pTULCE ），该载体允许通过IIS型BsaI依赖的Golden Gate模块化克隆组装两个部分（一个SP和一个目标基因）。这个特定的SP库筛选载体源自pPBEx2载体，包含一个T7 RNA聚合酶依赖的启动子、lac操作子调控区域和RBS、用于α互补的lacZ'基因（两侧为C和E融合位点），以及一个柔性接头和一个GFP11 检测标签。
通过使用SignalP 6.0算法分析ATCC 13032的所有注释蛋白质序列来鉴定C. glutamicum SP序列。SignalP 6.0识别出222个含有潜在SP的蛋白质。其中111个被预测为通过Sec转运子转运并被信号肽酶I切割的“标准”分泌型SP；96个为通过Sec转运子转运并被信号肽酶II切割的脂蛋白SP；5个为通过Tat转运子转运并被信号肽酶I切割的Tat SP；10个为通过Tat转运子转运并被信号肽酶II切割的Tat脂蛋白SP；没有发现由Sec转运子转运并被信号肽酶III切割的菌毛蛋白和类菌毛蛋白SP。将前30个Sec依赖性SP（SP001–SP031）克隆到CIDAR水平0 DVA-CD载体中，生成一个部分的C. glutamicum SP库。
使用角质酶和PETase验证筛选策略
该SP库最初使用来自Fusarium solani pisi的角质酶进行测试，因为该酶已被广泛用作评估C. glutamicum中蛋白质分泌效率的模型酶。来自Bacillus subtilis的中性蛋白酶（NprE）SP被作为阳性对照，因为它已被证明是C. glutamicum分泌角质酶的最佳SP之一。对于库筛选，所有水平1载体通过MoClo组装，将pTULCE 与编码所选SP之一的DVA-CD载体和携带角质酶基因作为GOI的DVA-DE载体组合。将所得质粒从大肠杆菌中分离出来，并用于转化基因组精简的C. glutamicum MB001(DE3)菌株，该菌株适用于T7依赖性基因表达。
通过split GFP测定和活性测定检测了30个SP产生的可变水平的角质酶分泌和活性。总的来说，通过SDS-PAGE检测的分泌蛋白量、split GFP测定和角质酶活性之间存在很好的相关性。SP001、SP007、SP016和SP028是表现最差的SP，无论是在蛋白质分泌量还是角质酶活性方面。在测试的变体中，SP002、SP025、SP030和SP031在分泌角质酶-GFP11 方面显示出最高的效率，与NprE相比，上清液中的蛋白产量提高了2.9至3.3倍，角质酶活性提高了1.9至2.8倍。
为了加速SP筛选并显著降低相关成本，研究人员测试了将MoClo反应直接转化到C. glutamicum中的可行性，绕过了对大肠杆菌转化和质粒分离的必要性。此外，不是为每个SP进行单独的反应，而是建立了一个包含所有SP的“一锅法”反应，然后筛选适当数量的克隆以鉴定最佳SP。该方法显著减少了时间和材料的使用。
对于涉及所有30个SP的MoClo反应，确保所有携带SP编码DNA片段的载体以等摩尔量存在至关重要，以便最终构建体具有相等的组装概率。用这个MoClo反应直接转化C. glutamicum MB001(DE3)，并在AutoBioTech平台上通过开发和实施涵盖挑斑、预培养接种、主培养培养和诱导、上清液分离以及split GFP测定孵育和检测的定制自动化程序，挑选和筛选了每个测试酶的数百个随机克隆。
该方法最初针对角质酶的分泌进行了测试。对前20个克隆进行测序显示存在两个SP，SP002和SP025，且出现频率相等。值得注意的是，SP002和SP025也是在单独测试时导致最高蛋白丰度和角质酶活性的两个SP。这一结果表明，一锅法随机方法是鉴定目标蛋白分泌最佳SP的有效方法。
相同的程序用于测试其他PETase酶的分泌，包括PHL7、HoceF265A 以及Ideonella sakaiensis PETase及其改进变体FAST-PETase。对于每种酶，筛选了273或282个随机克隆。对于PHL7-GFP11 分泌，在前十名中鉴定出三个SP：SP003、SP009和最常被鉴定出的SP030。对于HoceF265A -GFP11 ，与角质酶-GFP11 类似，SP002和SP025被鉴定为最佳SP。对于FAST-PETase-GFP11 和IsPETase-GFP11 ，由于它们非常相似，在这两种情况下都鉴定出SP026作为分泌这两种酶的最佳SP。
通过SDS-PAGE对每种POI的顶级候选者的沉淀上清液进行检查，确认了所需POI的存在。为了确认存在有活性的分泌型PETase酶，测试了在split GFP测定中具有最高值的培养上清液对p-硝基苯基丁酸酯的活性。所有构建体均检测到活性，其中PHL7-GFP11 和HoceF265A -GFP11 显示出最高的活性。
最后，为了确定生产了多少蛋白质，研究人员组装了构建体，这些构建体携带为三种在上清液中显示出显著酶活性的酶（角质酶、PHL7和HoceF265A ）所鉴定的最佳SP，以及一个C末端片段，该片段编码烟草蚀纹病毒（TEV）切割序列和一个通过柔性接头分隔的10×组氨酸标签（TEV-FL-10×His）。每种蛋白质都从培养上清液中分泌出来，并通过亲和层析直接纯化。获得的蛋白量不同，角质酶产量最高（72 mg/L），其次是PHL7（16 mg/L），然后是HoceF265A （9 mg/L）。所有三种蛋白质都显示出非常清晰的谱带，在PHL7和HoceF265A 的纯化组分中检测到一些低分子量的污染条带。
启动子和核糖体结合位点的优化
蛋白质生产及其分泌是重组蛋白生产中的两个主要应激因素。一方面，蛋白质过度生产可能导致显著的生长受损，并伴随无活性或错误折叠蛋白质的积累，这些蛋白质通常被导向降解。另一方面，输出蛋白的过度生产可能导致过度的分泌相关应激，对生长以及最终产生的蛋白质的总产量产生不利影响。优化生产和分泌应激水平可以使分泌蛋白水平提高高达70%。因此，控制产生的蛋白量对于最大化分泌重组蛋白的生产是强制性的。在这种情况下，筛选不同的启动子和RBS对于确定最佳表达水平非常有用。
本研究评估了来自CIDAR Addgene工具包的几个启动子和RBS，这些最初是为大肠杆菌开发的，以及三个常用于C. glutamicum中基因表达和蛋白质生产的启动子（PT7 、Ptac 和Psyn ）和C. glutamicum的共有RBS（AGGAG）。所有部分（启动子、RBS、SP、GOI、载体）均通过MoClo组装，使用SP025作为SP。
结果表明，PT7 是导致培养上清液中检测到的角质酶活性和split GFP信号最高的启动子。所有测试的大肠杆菌启动子在C. glutamicum中都具有活性，并且在与大肠杆菌中相同的趋势方面显示出强、中、弱的分类。对于双顺反子设计构建体（BCD2、BCD12和BCD8），无论它们之前在大肠杆菌中被分类为强、中、弱，它们在C. glutamicum中都显示出相同的强度。大肠杆菌和C. glutamicum之间BCD表达的差异先前已被观察到，表明两种生物在翻译方面存在重要差异。可以测试特定的C. glutamicum BCD。至于其他RBS构建体，无论是源自C. glutamicum共有序列的（带有或不带有lacO调控区域），还是被分类为中等（B0032m）和弱（B0033m）的大肠杆菌RBS，在产生的角质酶量及其活性方面都遵循预期的趋势。
结论与展望
研究人员开发了用于C. glutamicum的新合成生物学工具，可用于设计和测试最佳表达构建体，用于重组蛋白的生产、分泌和纯化。通过开发特定于生物体的SP库和适用于并行筛选多个模块化克隆部分的合适转录单元载体，能够鉴定用于C. glutamicum分泌角质酶的优良SP。使用一锅法模块化克隆方法和AutoBioTech平台的自动化高通量能力有助于加速发现与四种额外POI（PETases）分泌相关的最佳构建体所需的时间。使用该策略，将角质酶分泌提高了约3倍，并将最佳SP鉴定时间至少缩短了4倍。
这种方法不仅可用于鉴定改进的SP以用于蛋白质分泌，还可用于在不同生物体中筛选大型SP库，这可以扩展我们对SP功能的理解，并有助于改进计算工具，以预测用于特定蛋白质分泌和在所选生物体中的优化SP。
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