2.1 MdAMY1参与乙烯介导的淀粉降解
在'Starking Delicious'苹果果实发育后期（100-145 DAB），碘-碘化钾染色和扫描电镜观察显示淀粉含量持续下降，而乙烯释放量显著增加，二者呈负相关。转录组分析发现α-淀粉酶基因MdAMY1在淀粉和蔗糖代谢通路中显著富集。RNA原位杂交和RT-qPCR证实MdAMY1表达随果实成熟逐渐上调，且与淀粉含量负相关。乙烯前体ACC处理促进淀粉降解，而抑制剂1-MCP处理抑制此过程。在'Gala'×'Mato 1'F1群体中，MdAMY1表达与淀粉含量呈负相关，证明其是乙烯介导淀粉降解的关键正调控因子。
2.2 MdAMY1作为细胞壁定位的α-淀粉酶促进淀粉降解
蛋白结构分析显示MdAMY1具有典型的α-淀粉酶结构域。亚细胞定位实验发现MdAMY1定位于细胞壁。体外酶活实验证实重组MdAMY1-His蛋白能有效降解可溶性淀粉。在苹果果实中瞬时过表达MdAMY1可降低淀粉含量并提高可溶性糖（果糖、葡萄糖、蔗糖）水平，而沉默MdAMY1则产生相反表型。稳定转基因愈伤组织实验进一步验证了MdAMY1在淀粉降解中的正向调控作用。
2.3 MdbHLH149直接抑制MdAMY1转录
酵母单杂交筛选发现bHLH转录因子MdbHLH149能结合MdAMY1启动子。亚细胞定位显示MdbHLH149定位于细胞核。发育表达分析表明MdbHLH149在果实成熟过程中下调表达，与淀粉含量正相关。瞬时过表达MdbHLH149增加淀粉积累并降低可溶性糖含量，而沉默MdbHLH149促进淀粉降解。染色质免疫共沉淀和凝胶迁移实验证实MdbHLH149通过结合MdAMY1启动子中的E-box顺式元件直接抑制其转录。
2.4 MdERF17增强MdbHLH149的转录抑制功能
酵母双杂交、双分子荧光互补和体外pull-down实验证实MdERF17与MdbHLH149存在物理互作。在苹果果实中过表达MdERF17抑制淀粉降解，而沉默MdERF17促进此过程。GUS报告基因实验显示MdERF17能增强MdbHLH149对MdAMY1启动子的转录抑制活性。组合沉默实验证明MdERF17通过MdbHLH149间接调控MdAMY1表达，形成MdERF17-MdbHLH149-MdAMY1调控模块。
2.5 乙烯信号整合调控模块功能
乙烯前体ACC处理显著诱导MdAMY1启动子活性，同时抑制MdbHLH149和MdERF17的启动子活性。在ACC处理背景下，同时沉默MdERF17和MdbHLH149能协同增强MdAMY1表达，促进淀粉降解。这些结果说明乙烯通过抑制MdERF17-MdbHLH149模块的转录，解除对MdAMY1的抑制，从而激活淀粉降解通路。
3 讨论
本研究首次揭示了乙烯通过转录抑制模块调控淀粉降解的新机制。在果实发育早期，高表达的MdERF17和MdbHLH149形成蛋白复合物，抑制MdAMY1表达，维持淀粉储存。乙烯爆发后，该抑制模块被解除，MdAMY1表达上调，启动淀粉向可溶性糖转化。这种精细调控机制确保了能量物质在果实发育不同阶段的合理分配，为通过分子育种改良果实品质提供了理论依据。该模块组分可作为CRISPR/Cas9靶点，用于培育高糖分或耐贮运苹果新品种。
