肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其治疗充满挑战。传统的治疗手段如射频消融、经动脉化疗栓塞和手术切除，对部分患者有效，但由于肿瘤异质性和潜在的肝脏疾病，往往难以防止复发。近年来，癌症免疫疗法，特别是基于嵌合抗原受体（CAR）的策略，为癌症治疗带来了革命性变化。其中，CAR修饰的自然杀伤细胞（CAR-NK）疗法作为一种有前景的细胞免疫疗法崭露头角，与CAR-T细胞疗法相比，其引发严重移植物抗宿主病和细胞因子释放综合征的风险较低。然而，在HCC中，CAR-NK细胞的疗效常常受到两个关键因素的限制：一是难以有效浸润到肿瘤内部，二是肿瘤内部存在一个 profoundly 免疫抑制的肿瘤微环境（TME），这个环境严重削弱了包括NK细胞在内的免疫细胞的功能。
为了突破这一瓶颈，研究人员将目光投向了另一种已被美国食品药品监督管理局（FDA）临床批准的肿瘤局部治疗技术——不可逆电穿孔。IRE是一种非热消融技术，它通过施加高压脉冲电场，在肿瘤细胞膜上形成不可逆的孔洞，从而诱发肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（ICD）。ICD的过程会释放损伤相关分子模式（DAMPs，如ATP、HMGB1）、促炎细胞因子和趋化因子，如同在体内进行了一次“原位疫苗接种”，能够重塑肿瘤免疫微环境，将其从“免疫沙漠”状态转变为“免疫炎症”状态。但既往研究也表明，单独使用IRE所获得的抗肿瘤控制效果是有限的。那么，如果将能够重塑TME的IRE与具有精准靶向杀伤能力的CAR-NK细胞疗法结合起来，是否会产生“1+1>2”的协同效应，为HCC治疗带来新的突破呢？
这项发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》的研究，正是为了回答这个问题。研究人员开发了一种组合策略，将IRE与靶向HCC中过度表达的肿瘤相关抗原——磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）的CAR-NK细胞相结合。其中，CAR-NK细胞是通过一种由1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷（DOTAP）功能化的脂质纳米颗粒（DLNP）递送基因工程化而成的。这项研究旨在阐明IRE如何调控HCC的TME以增强CAR-NK细胞的疗效，并验证该联合疗法的协同抗肿瘤作用。
为开展此项研究，作者运用了多项关键技术方法。在体外，使用脉冲电场（PEF）模拟IRE处理，研究其对肝癌细胞系（人源Huh-7和小鼠源Hepa1c1c7）免疫原性及对NK细胞敏感性的影响。利用患者来源的HCC类器官（HCC-PDOs）进行临床前药效评估。在体内，建立了多种小鼠模型，包括Huh-7细胞皮下移植瘤模型（使用NSG和裸鼠）、Hepa1c1c7细胞原位肝移植瘤模型（使用C57BL/6和裸鼠），以评估联合疗法的疗效与安全性。采用动态光散射、冷冻电镜表征DLNP的物理性质，并通过流式细胞术、免疫印迹、酶联免疫吸附测定、免疫荧光、趋化因子阵列、活性氧检测等多种分子与细胞生物学技术，深入探究了IRE联合CAR-NK治疗的潜在作用机制。
研究结果
不可逆电穿孔调节肝细胞癌的肿瘤免疫微环境
研究人员首先在小鼠原位HCC模型中发现，IRE治疗后，肿瘤组织内浸润的免疫细胞显著增加。进一步分析显示，IRE处理后的HCC肿瘤中，包括CX3CL1、CCL6、CCL9/10、CXCL9等在内的多种趋化因子表达水平上调。同时，肿瘤内自然杀伤细胞（NK细胞）在IRE后3小时即开始显著增加，中性粒细胞在6小时后积累，树突状细胞（DCs）在72小时后明显增多。免疫荧光成像也证实，IRE处理后肿瘤组织中NKp46+ NK细胞分布增加。这些结果表明，IRE能够通过促进趋化因子释放，特别是招募NK细胞等先天性免疫细胞，来调节HCC的肿瘤免疫微环境。
脉冲电场通过CX3CL1介导的趋化作用促进NK细胞向肝癌细胞募集
为了探究其机制，研究在体外用PEF处理肝癌细胞。发现PEF可诱导肝癌细胞发生ICD，表现为细胞外ATP和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放增加，以及钙网蛋白在细胞表面的呈现增多。重要的是，PEF处理的肝癌细胞条件培养基能显著促进人NK细胞系（NK92MI）和小鼠原代NK细胞的迁移。机制研究发现，PEF处理后肝癌细胞释放的趋化因子CX3CL1水平显著升高，体内实验也证实IRE后肿瘤组织CX3CL1表达上调。使用中和抗体阻断CX3CL1，可显著抑制NK细胞向PEF条件培养基的迁移。此外，迁移至PEF处理癌细胞旁的NK细胞能有效激活癌细胞中的Caspase-3/7，诱导其凋亡。这揭示了IRE通过诱导CX3CL1释放来招募NK细胞的机制。
脉冲电场诱导的免疫原性信号和氧化应激使残留肝癌细胞对NK细胞敏感
除了招募，研究还发现PEF处理能增强残留肝癌细胞对NK细胞介导的细胞毒作用的敏感性。与未处理的对照相比，PEF处理的Huh-7和Hepa1c1c7细胞在与人或鼠NK细胞共培养时，被溶解的程度显著更高。机制探索表明，PEF处理可诱导肝癌细胞内活性氧（ROS）水平升高约2倍。当用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除ROS后，PEF处理细胞对NK细胞的敏感性恢复至对照水平。进一步研究发现，PEF条件培养基也能诱导癌细胞产生ROS，而这一过程与DAMP分子HMGB1的释放有关。在HMGB1敲低的细胞中，PEF诱导的ROS生成及其对NK细胞的敏感性均被削弱。这些结果说明，PEF通过DAMP-ROS轴使残留肝癌细胞对NK细胞杀伤更敏感。
利用阳离子脂质纳米颗粒对NK细胞进行基因工程改造
为了增强NK细胞对HCC的特异性杀伤，研究团队采用其之前开发的DLNP平台，将编码抗人GPC3 CAR或抗鼠Gpc3 CAR的mRNA递送至NK细胞中，成功制备了CAR-NK细胞。表征显示DLNP粒径约150纳米，zeta电位约+30 mV，mRNA包封率超过90%。免疫印迹证实了CAR-NK细胞中CD3ζ链的表达，表明CAR构建成功。
脉冲电场与抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 CAR-NK细胞对肝癌细胞的体外协同作用
体外实验证实了协同效应。与对照NK细胞相比，抗GPC3 CAR-NK细胞对PEF处理的Huh-7和Hepa1c1c7细胞展现出更强的细胞毒作用。共培养成像显示CAR-NK92MI细胞能更有效地识别和结合PEF处理的癌细胞，并诱导更强的Caspase-3激活和ROS产生。在使用HCC患者来源类器官的实验中，同样观察到PEF联合CAR-NK92MI能最有效地激活Caspase-3/7。
不可逆电穿孔联合抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 CAR-NK细胞疗法对肝细胞癌的增强抗肿瘤作用
体内实验在多种小鼠模型上验证了联合疗法的优越性。在Huh-7移植瘤模型中，IRE联合CAR-NK92MI治疗组表现出最显著的肿瘤生长抑制和最高比例的肿瘤完全消退小鼠，且不引起体重变化。在Hepa1c1c7原位肝癌模型中，联合治疗同样显示出最强的抗肿瘤效果，肿瘤内坏死和凋亡区域增加，NK细胞浸润增多，局部干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平上调，一系列趋化因子表达增强。血清生化分析显示，联合治疗能显著恢复天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）等肝功能指标至接近正常水平，且主要脏器未发现不良反应。
不可逆电穿孔联合抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 CAR-NK细胞增强树突状细胞和细胞毒性T细胞免疫
研究还发现，联合疗法的影响超越了先天免疫。在免疫健全的C57BL/6小鼠原位HCC模型中，IRE联合CAR-mNK治疗不仅增加了肿瘤内DCs的频率，还显著提升了DCs表面共刺激分子CD86和CD80的表达水平，表明DCs被有效激活。同时，肿瘤内浸润的CD8+ 和CD4+ T细胞也显著增多。更重要的是，从联合治疗组小鼠脾脏分离的CD8+ T细胞，在受到Hepa1c1c7细胞抗原刺激后，产生IFN-γ的比例和强度最高。这表明联合疗法能 够 驱 动 强 大
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