1 一个世纪的嗜酸性粒细胞研究遗产与其未解之谜
嗜酸性粒细胞由保罗·埃尔利希于1879年在人类中首次描述，最初被定性为一类次要的白细胞亚群，其细胞质可被酸性苯胺染料（尤其是伊红）强烈染色。整个20世纪，研究证实其在寄生虫感染和过敏过程中数量增加，提供了初步的功能特征。随后的生物化学和显微镜进展鉴定出关键嗜酸性粒细胞颗粒蛋白，如主要碱性蛋白（MBP）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPX）和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）。至1980年代，白细胞介素（IL）-5被描述为关键的嗜酸性粒细胞生长因子，是嗜酸性粒细胞生成和存活所必需的，这为后来使用抗IL-5单克隆抗体靶向治疗严重但知之甚少的高嗜酸性粒细胞性疾病奠定了基础。总体而言，直到2000年代，对嗜酸性粒细胞功能、特性及其宿主损伤潜力的全部理解均可纳入免疫学（且更多时候是免疫病理学）的框架内。
如今情况已大不相同：分子生物学强大工具和方法的出现揭示了明显超越传统学科边界的现象。现在，嗜酸性粒细胞吸引了众多并非免疫病理学家甚至免疫学家的科学家。本综述旨在为这些新来者提供基础的概念工具包，从嗜酸性粒细胞生物学三个迅速发展的方面开始：进化、个体发育以及与来自不同微环境的细胞和信号的相互作用。
1.1 进化
嗜酸性粒细胞及其独特的蛋白质组成存在于许多脊椎动物物种中，仅有微小变异。通常的假设是，这种独特细胞类型的进化保守性反映了该细胞某种（未明确的）特性赋予动物的生存优势。检验此种假设的常用方法是检查缺乏嗜酸性粒细胞或特定嗜酸性粒细胞产物的动物模型是否会处于某种劣势。然而，缺乏嗜酸性粒细胞的基因修饰小鼠（见下文）并未表现出明显的疾病。抗IL-5单克隆抗体治疗也得出了类似结论，该治疗能降低动物模型和人类嗜酸性粒细胞数量，而无明显不良反应。但这种方法与基因敲除模型一致，并非嗜酸性粒细胞特异性：在人类中，IL-5作用于嗜酸性粒细胞祖细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和中性粒细胞（在哮喘和慢性阻塞性肺病中）；在小鼠中，它激活嗜碱性粒细胞并刺激B-1细胞，促进黏膜IgA产生。因此，过去25年间大量研究组证实嗜酸性粒细胞执行许多意想不到功能（其中一些相当有益）的证据，应被我们可以在没有它们的情况下正常生活这一事实所冷静看待。
1.2 个体发育
嗜酸粒细胞生成，即骨髓中嗜酸性粒细胞的产生过程，受到细胞因子、转录因子和细胞信号的严格调控。它是粒细胞生成这一更广泛过程的特例。造血干细胞（HSC）产生髓系祖细胞，后者在信号线索和转录因子影响下分化为嗜酸性粒细胞祖细胞（EoP）。EoP以表达IL-5受体α（IL-5Rα）为特征，对IL-5作出反应，IL-5是其增殖、分化和存活的关键细胞因子。IL-5通过IL-5Rα复合物发出信号，激活驱动嗜酸性粒细胞成熟的细胞内通路。转录因子包括GATA-1、PU.1、C/EBPα和XBP1，在嗜酸粒细胞生成中起重要作用。GATA-1对于嗜酸性粒细胞谱系定型至关重要，GATA-1突变模型完全缺乏嗜酸性粒细胞证明了这一点，这是由于消除了GATA-1基因中驱动该基因自动放大的序列。PU.1和C/EBPα调控参与颗粒形成和细胞骨架重塑的基因。XBP1支持分化过程中正常的颗粒形成和内质网功能。粒细胞发生，即细胞毒性颗粒的有序形成，对嗜酸性粒细胞功能至关重要：在缺乏颗粒蛋白（包括MBP和EPX）的小鼠中观察到粒细胞发生受损，导致嗜酸粒细胞生成缺陷。
1.3 相互作用与网络化
离开骨髓后，嗜酸性粒细胞在血液中短暂循环，然后迁移到胃肠道、肺和胸腺等组织。在组织中，局部分泌的细胞因子，包括IL-5和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），通过阻止凋亡来调节其存活，从而延长其寿命。可以设想，拥有嗜酸性粒细胞这种难以捉摸的适应性优势可能反映了嗜酸性粒细胞与实体组织中的其他免疫和非免疫细胞类型之间的网络化过程。此类网络化过程通常涉及冗余通路，即使在没有嗜酸性粒细胞的情况下也能确保生存（因此，嗜酸性粒细胞可能并非不可或缺，尽管它们可能很重要）。
2 嗜酸性粒细胞功能
2.1 先从一些真正的好消息说起：微环境的维护与微调
当前对嗜酸性粒细胞的大部分热情基于过去二十年间的发现，这些发现 extrapolate 了免疫系统的设定。与早期研究侧重于免疫病理学相反，许多看似有益的现象现在可归因于嗜酸性粒细胞。在维持组织稳态方面，嗜酸性粒细胞在多个器官（包括胃肠道、脂肪组织、肺和生殖器官）中扮演多种 distinct 角色。在这些部位，常驻嗜酸性粒细胞有助于上皮屏障完整性和局部免疫环境的调节。例如，在小肠中，嗜酸性粒细胞促进上皮细胞更新并响应微生物定植调节巨噬细胞成熟。类似地，在脂肪组织中，嗜酸性粒细胞通过释放脂联素和一氧化氮帮助维持血管和代谢稳态，这对血管张力和葡萄糖代谢至关重要。因此，嗜酸性粒细胞缺乏会导致全身性炎症和代谢功能受损。在2型糖尿病中，较高的嗜酸性粒细胞水平与胰岛素抵抗呈负相关，提示其在葡萄糖调节中具有显著的保护作用，即使在严重的代谢疾病过程中也是如此。从概念上讲，这非常重要，因为它展示了嗜酸性粒细胞在特定部位和背景下作为抗炎细胞的作用，从而显著脱离了早期强调嗜酸性粒细胞在过敏和感染/寄生虫性疾病中促炎作用的免疫学文献。
嗜酸性粒细胞也积极参与伤口愈合和组织修复过程。例如，在角膜伤口愈合中，嗜酸性粒细胞通过12/15-脂氧合酶途径释放脂质介质，促进炎症消退并增强组织修复。类似地，嗜酸性粒细胞在生殖周期中贡献于子宫重塑，促进着床和妊娠维持所需的结构变化。
2.2 然后我们有一些令人沮丧的旧闻
嗜酸性粒细胞与多种病理状况有关。在哮喘和嗜酸性粒细胞性食管炎中，它们通过释放细胞毒性颗粒蛋白、细胞因子（如IL-4和IL-13）和脂质介质加剧炎症和组织重塑。在嗜酸性粒细胞性哮喘中，它们在气道重塑中的作用加重了疾病严重程度，并导致对皮质类固醇等疗法的抵抗。类似地，在慢性鼻-鼻窦炎中，嗜酸性粒细胞浸润鼻组织导致持续性炎症和息肉形成。嗜酸性粒细胞也调节免疫反应，作为抗原呈递细胞并与T和B淋巴细胞相互作用以塑造免疫。它们产生细胞因子，包括IL-4和IL-13，突出了它们参与2型免疫，特别是在过敏性疾病和哮喘中。
虽然上述参考文献来自过去十年，但关于嗜酸性粒细胞促进过敏性疾病（包括哮喘）并在没有有效的抗蠕虫免疫反应时造成组织损伤的经典观察至少可以追溯到三十年前。因此是“旧”闻。过敏性疾病（包括哮喘）和蠕虫感染往往是慢性疾病，其中涉及细胞和特异性抗体类别（IgE和IgG1 ）的抗原特异性免疫反应与慢性激活的非特异性防御机制（包括那些依赖于嗜酸性粒细胞的机制）共存。
2.3 最后，现实是复杂的
嗜酸性粒细胞在不同的感染性疾病中扮演多种角色。它们通过释放细胞毒性颗粒参与宿主防御蠕虫；在不同背景下，它们通过形成胞外陷阱对抗微生物病原体。它们的贡献可能被复杂的寄生虫所利用，曼氏血吸虫就是一个例子：在慢性 established 血吸虫病中，成虫伴侣在循环中产下的卵随后被困在腹部组织中，最终在嗜酸性粒细胞的帮助下实现环境中的 liberation，嗜酸性粒细胞通过降解宿主组织促进寄生虫卵从肠道排出。这种对寄生虫有利的机制（从而推动其进入发育周期的下一阶段——感染无脊椎动物螺类宿主）通过脾脏和肝脏血管中不可逆的纤维化对脊椎动物宿主造成严重和永久性损伤。
癌症生物学为嗜酸性粒细胞展示环境依赖性角色提供了许多可能性，有证据支持其抗肿瘤和促肿瘤活性。抗肿瘤功能包括通过颗粒蛋白释放（MBP、EPX、ECP）的直接细胞毒性、活性氧（ROS）的产生、CD8+ T细胞和NK细胞的募集和激活，以及由CXCL9/CXCL10和IFN-γ相关通路介导的血管生成抑制作用。相反，嗜酸性粒细胞也可能通过支持组织重塑、分泌促血管生成介质（包括VEGF和基质金属蛋白酶）、增强Th2偏向的免疫以及促成有利于肿瘤生长的免疫抑制微环境来促进肿瘤进展。这些不同的活动取决于肿瘤类型、炎症环境和局部细胞因子线索，强调了嗜酸性粒细胞-肿瘤相互作用的复杂性和高度可塑性。胶质母细胞瘤，中枢神经系统的一种主要癌症类型， exemplifies 嗜酸性粒细胞所扮演角色的复杂性：研究表明嗜酸性粒细胞浸润肿瘤组织通过Fas/FasL相互作用和caspase-3激活诱导肿瘤细胞凋亡。此外，嗜酸性粒细胞释放细胞毒性介质，如ROS和ECP，损害肿瘤细胞增殖。有趣的是，以嗜酸性粒细胞增多以及IL-5和半胱氨酰白三烯升高为特征的哮喘患者显示出更好的胶质母细胞瘤预后，提示这些因子中的一个或几个具有保护性抗肿瘤作用。相反，促肿瘤效应源于肿瘤衍生的介质，特别是GM-CSF，它维持嗜酸性粒细胞存活和激活，诱导释放生长因子（如双调蛋白、TGF-α、VEGF）和炎症警报素（S100A8/A9），通过RAGE依赖性通路促进EGFR信号、血管生成和肿瘤细胞增殖。因此，嗜酸性粒细胞作为免疫调节细胞，其对肿瘤进展的影响取决于主导的细胞因子环境和微环境背景。
3 可视化嗜酸性粒细胞：技术与方法
嗜酸性粒细胞的可视化技术多年来已显著发展，涵盖了多种允许详细观察其结构、功能和相互作用的技术。这些方法范围从常规和特殊染色法到先进的免疫组织化学、免疫荧光和电子显微镜。以下是这些方法学、其应用和重要性的全面讨论。
3.1 嗜酸性粒细胞染色
嗜酸性粒细胞最初使用常规染色如苏木精和伊红（H&E）进行鉴定，该染色在光学显微镜下用伊红染料突出显示其嗜酸性颗粒。虽然对基本观察有用，但这些染色缺乏特异性，难以在复杂组织中区分嗜酸性粒细胞。有几种其他经典和专门的组织化学染色可用于嗜酸性粒细胞鉴定，如Wright-Giemsa、Luna染色、pH 10.2的天狼星红、固绿/中性红等。鼠类EPX对氰化物的抗性也有助于嗜酸性粒细胞分化。与二氨基联苯胺（DAB）的细胞化学反应显示EPX活性，通过显色沉淀突出显示嗜酸性粒细胞。荧光染料如伊文思蓝也通过与阳离子颗粒相互作用强烈染色嗜酸性粒细胞。伊文思蓝在红色光谱（~680 nm）发出荧光，便于炎症研究中的可视化。天狼星红在偏振光或荧光显微镜下显示荧光，进一步将嗜酸性粒细胞与其他细胞区分开。免疫组织化学和免疫荧光可以通过靶向MBP、EPX和夏科-莱登晶体（半乳糖凝集素10）等标记物改进嗜酸性粒细胞检测。在小鼠组织中，H&E染色可能不足以可靠地鉴定嗜酸性粒细胞，因为它们的颗粒染色较弱，缺乏人类样本中观察到的特征性亮嗜酸性。为了精确检测，应使用针对颗粒特异性蛋白的技术（例如IHC）可视化嗜酸性粒细胞，从而实现精确定位和定量。
嗜酸性粒细胞的形态在脊椎动物中大致保守，但存在谱系特异性变异，这在将动物模型 extrapolate 到人类疾病时是一个相关点。如图1所示，来自不同物种的嗜酸性粒细胞在大小、核形态、颗粒结构和染色特性方面有所不同。在变温脊椎动物如鱼类、两栖类和爬行类中，嗜酸性粒细胞通常具有圆形、外周定位的细胞核，但显示不同的细胞质染色模式，提示颗粒生物化学的 divergence。物种间在嗜酸性粒细胞丰度、颗粒形态和组织分布上的差异之所以重要，主要是因为它们影响这些细胞在实验系统中被检测和解释的方式。认识到这些差异在使用动物模型将免疫机制 extrapolate 到其他物种（特别是在寄生虫感染、过敏和黏膜免疫的研究中）时至关重要。
3.2 电子显微镜：嗜酸性粒细胞的超微结构特征
嗜酸性粒细胞表现出标志性的超微结构特征，最好使用透射电子显微镜（TEM）观察。其细胞质含有具有致密结晶状MBP核心的颗粒，周围是由ECP、EPX和嗜酸性粒细胞衍生神经毒素（EDN）富集的电子透明基质。嗜酸性粒细胞 sombrero 囊泡是通过先进TEM和电子断层扫描识别的管状-囊泡结构，通过选择性运输颗粒储存的蛋白质促进 piecemeal 脱颗粒。脂质体，细胞质中的电子致密球形细胞器，作为合成和储存脂质介质（如白三烯和前列腺素）的细胞内位点。嗜酸性粒细胞显示双叶核，这是一个定义性的形态学特征。扫描电子显微镜（SEM）显示其伪足，对迁移和细胞相互作用至关重要。嗜酸性粒细胞胞外陷阱（EETs），由DNA和颗粒蛋白组成，在SEM和TEM下呈现网状结构，突出了其病原体捕获作用。
电子显微镜为研究嗜酸性粒细胞超微结构提供了无与伦比的分辨率，尽管有其局限性，包括复杂的样品制备、静态成像和高成本。像保存近天然状态的冷冻电子显微镜和能够进行3D重建的电子断层扫描等进步解决了其中一些挑战。这里描述的超微结构特征在高分辨率电子显微镜下最能被欣赏。优秀的注释电镜图像可以在Melo及其同事的经典研究中找到，这些研究清晰地描绘了嗜酸性粒细胞颗粒及其亚结构组织。
3.3 流式细胞术
尽管嗜酸性粒细胞由于其致密的颗粒通常表现出高侧向角散射（SSC），但仅基于SSC的鉴定不够特异，因为中性粒细胞和其他粒细胞可能显示重叠值。此外，嗜酸性粒细胞脱颗粒可显著降低SSC，使得该参数在激活或发炎的样本中不可靠。嗜酸性粒细胞表现出不同的表面标志物，这些标志物因物种、成熟状态和功能角色而异。在人类中，嗜酸性粒细胞祖细胞表达CD34（HSC的标志物）和CD123（IL-3Rα），表明早期髓系分化。IL-5Rα（CD125）是嗜酸性粒细胞分化和增殖所必需的，而 Sca-1 标志着向嗜酸性粒细胞谱系的转变。成熟嗜酸性粒细胞表达 Siglec-8（一种诱导凋亡的特异性标志物）和 CCR3（CD193）（一种能够向 eotaxins 迁移的趋化因子受体）。其他标志物包括CD45（通过其同种型指示激活状态）、CD11b（参与粘附和组织浸润）和CD125（在2型炎症中上调）。在小鼠嗜酸性粒细胞中，未成熟阶段也表达CD34、CD123和CD125，其中 Sca-1 特异性于鼠类祖细胞。成熟嗜酸性粒细胞通过 Siglec-F（Siglec-8 的鼠类对应物）、CD11b、CCR3 和 CD62L（L-选择素）来鉴定，后者指示组织驻留和免疫相互作用。激活标志物包括CD69（在炎症反应中上调）和MHC II类分子（在具有抗原呈递功能的嗜酸性粒细胞中表达）。CD123（IL-3Rα）在炎症期间的组织嗜酸性粒细胞中增强，反映了它们增强的活性。表1概述了用于人和小鼠流式细胞术的嗜酸性粒细胞标志物，涵盖了祖细胞和成熟嗜酸性粒细胞。
4 嗜酸性粒细胞减少症：原因、实验模型和诱导方法
嗜酸性粒细胞减少症，即嗜酸性粒细胞计数异常低，由生理性、病理性和药理性原因引起。应激诱导的嗜酸性粒细胞减少症，由皮质类固醇水平升高驱动，是常见的，并导致嗜酸性粒细胞凋亡。这种机制在应激条件下或糖皮质激素治疗中已有充分记载，这些治疗能迅速消耗循环中的嗜酸性粒细胞。急性细菌感染也引起嗜酸性粒细胞减少症，因为嗜酸性粒细胞被募集到发炎组织，并且全身性炎症抑制嗜酸粒细胞生成。严重的全身性炎症，如脓毒症，通过组织募集和骨髓抑制加剧嗜酸性粒细胞减少症。药理学药物，包括前列腺素 E2 和 cAMP 升高药物，通过一氧化氮依赖性通路抑制嗜酸性粒细胞分化并促进祖细胞凋亡。这些药物可用于实验性消耗嗜酸性粒细胞。系统性疾病如系统性红斑狼疮和再生障碍性贫血也通过骨髓抑制和全身性炎症引起嗜酸性粒细胞减少症。
诱导嗜酸性粒细胞减少症的实验方法为了解嗜酸性粒细胞生物学提供了见解。遗传模型，如缺乏GATA-1自动放大或IL-5的嗜酸性粒细胞缺陷小鼠，显示近乎完全的嗜酸性粒细胞缺失，使得可以推断嗜酸性粒细胞在体内免疫和疾病中扮演哪些角色。药理学方法，包括如美泊利珠单抗（mepolizumab）的抗IL-5单克隆抗体，中和IL-5以消耗嗜酸性粒细胞。抗IL-5Rα单克隆抗体贝那利珠单抗（benralizumab）通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性诱导快速且近乎完全的嗜酸性粒细胞耗竭，该过程主要由NK细胞通过去岩藻糖基化的Fc增强的FcγRIII接合所介导。如二乙卡马嗪（diethylcarbamazine）的化学试剂通过激活凋亡通路诱导嗜酸性粒细胞减少症。
5 嗜酸性粒细胞增多症：机制、原因、相关疾病和实验模型
嗜酸性粒细胞增多症，定义为血液或组织中嗜酸性粒细胞数量增加，是各种疾病和免疫反应的标志。可分类为原发性、继发性或特发性。原发性嗜酸性粒细胞增多症罕见，源于骨髓疾病，如高嗜酸性粒细胞综合征或骨髓增殖性肿瘤，常与遗传突变（如血小板衍生生长因子受体重排）相关。继发性嗜酸性粒细胞增多症是最常见的类型，由外部刺激引发，如过敏原、寄生虫感染、自身免疫性疾病或药物反应。
区分血液 嗜酸性粒细胞增多症（循环嗜酸性粒细胞增加）和组织 嗜酸性粒细胞增多症（反映器官内的局部募集和积聚）非常重要。这些区室并不总是相关：患者可能显示正常的血液嗜酸性粒细胞计数，尽管有明显的组织浸润，或者相反，呈现外周嗜酸性粒细胞增多而无实质性的组织受累。在过敏性疾病如哮喘中，血液和组织嗜酸性粒细胞增多均由Th2细胞因子如IL-5（促进嗜酸性粒细胞分化）和 eotaxin-1（促进嗜酸性粒细胞募集）驱动。在嗜酸性粒细胞性哮喘中，嗜酸性粒细胞在气道积聚，释放毒性颗粒蛋白，导致上皮损伤和气道上皮重塑。类似地，在嗜酸性粒细胞性食管炎中，嗜酸性粒细胞浸润食管，响应食物过敏原引起炎症和纤维化。
寄生虫感染，特别是由蠕虫引起的感染，经典地与血液和组织嗜酸性粒细胞增多相关。例如，类类圆线虫感染诱导以IL-5水平升高为特征的Th2反应。其他寄生虫（例如，犬弓蛔虫、旋毛虫、细粒棘球绦虫）也与嗜酸性粒细胞增多相关。药物诱导的嗜酸性粒细胞增多常由对非甾体抗炎药、青霉素类、头孢菌素类和抗惊厥药等药物的超敏反应引起。这些反应可表现为全身症状，如伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状的药物反应（DRESS）综合征。自身免疫性疾病如嗜酸性肉芽肿性多血管炎涉及嗜酸性粒细胞驱动的炎症、系统性血管炎和Th2细胞因子反应。嗜酸性粒细胞性肺炎，以嗜酸性粒细胞肺浸润为特征，可以是特发性的或继发于感染、药物或自身免疫性疾病。
嗜酸性粒细胞增多症的实验模型增进了我们对嗜酸性粒细胞生物学的理解。IL-5转基因小鼠表现出严重且慢性升高的嗜酸性粒细胞产生和外周/组织嗜酸性粒细胞增多。过敏原攻击模型，如卵清蛋白致敏，提供了对嗜酸性粒细胞在过敏性炎症中作用的见解。寄生虫感染模型如曼氏血吸虫或广州管圆线虫诱导组织和血液嗜酸性粒细胞增多，突出了嗜酸性粒细胞介导的免疫反应。外科和炎症模型，包括热凝固蛋清植入，诱导依赖于糖皮质激素和5-脂氧合酶通路的局部嗜酸性粒细胞增多，为研究嗜酸性粒细胞募集和激活提供了工具。人源化小鼠模型，涉及将人嗜酸性粒细胞移植到免疫缺陷小鼠中，促进了人类特异性嗜酸性粒细胞疾病的研究和治疗剂的测试。
6 嗜酸性粒细胞分离：方法与进展
嗜酸性粒细胞分离用于研究其细胞生物学、功能特性及其对多种疾病的贡献。由于大多数人的血液中嗜酸性粒细胞计数低，这很难实现。然而，有效的纯化方法已经开发出来，包括密度梯度离心、免疫磁珠分离、荧光激活细胞分选（FACS）和组织特异性分离技术。虽然许多早期研究试图从血液中纯化嗜酸性粒细胞，但技术进步使我们能够研究组织样本（如来自发炎的哮喘肺、寄生虫诱导的肉芽肿或嗜酸性粒细胞性食管炎活检）中的嗜酸性粒细胞。组织嗜酸性粒细胞在表型和功能上不同于外周血嗜酸性粒细胞，需要量身定制的方案以保留其独特特性。从组织中分离嗜酸性粒细胞通常涉及酶消化以产生单细胞悬液。常用酶包括胶原酶、分散酶和DNase，它们降解细胞外基质并释放细胞。例如，来自过敏原攻击小鼠的肺组织用胶原酶和DNase消化以分离嗜酸性粒细胞用于进一步分析。酶和条件的选择至关重要，因为过于剧烈的处理可能损伤嗜酸性粒细胞或改变表面标志物表达，损害其鉴定和功能完整性。在制备单细胞悬液后，使用密度梯度离心或直接使用免疫磁珠或流式细胞术方法富集嗜酸性粒细胞。这些方法确保了下游应用所需的高纯度嗜酸性粒细胞群体。
6.1 密度梯度离心
密度梯度离心是一种广泛使用且高效的分离嗜酸性粒细胞的方法，利用了它们与其他细胞类型不同的浮力密度。该技术采用如Ficoll或Percoll的梯度介质，这些介质创建密度层，允许细胞在离心过程中分离。在人类中，嗜酸性粒细胞通常具有1.088–1.093 g/mL的浮力密度，略低于中性粒细胞，高于单核细胞如淋巴细胞和单核细胞。Ficoll-Paque常用于人类样本，因为它创建了粒细胞和单核细胞之间的清晰界面，便于从外周血中分离嗜酸性粒细胞用于各种应用。鼠类嗜酸性粒细胞具有稍低的浮力密度，约1.085–1.090 g/mL。不连续Percoll梯度可用于分离嗜酸性粒细胞，通常范围从40%到75%。其他动物模型可能需要特定的方案。值得注意的是，在标准的Ficoll或Histopaque密度梯度中，嗜酸性粒细胞不会出现在PBMC层。由于其较高的密度，它们与红细胞和中性粒细胞一起沉降在底部沉淀中。因此，Ficoll主要用于消耗淋巴细胞和单核细胞，之后可以使用低渗裂解、Percoll梯度或阴性选择方法从富含粒细胞的组分中富集嗜酸性粒细胞。
6.2 阴性选择
阴性选择是一种广泛使用的方法，用于分离嗜酸性粒细胞同时保留其功能状态。与直接靶向嗜酸性粒细胞的阳性选择不同，阴性选择消耗其他白细胞群体，确保嗜酸性粒细胞保持未接触状态且存活。这使其特别适用于功能研究，如转录组学、蛋白质组学和体外测定。该技术采用靶向非嗜酸性粒细胞表面标志物（如CD16（中性粒细胞）、CD3（T细胞）、CD19（B细胞）和CD56（自然杀伤细胞）的抗体混合物。这些与磁珠偶联的抗体结合不需要的细胞，然后通过磁场去除，留下高度富集且功能完整的嗜酸性粒细胞。尽管有其优点，阴性选择也有局限性。可能发生细胞损失，因为一些嗜酸性粒细胞可能粘附到消耗抗体上，降低产量。抗体混合物和磁珠系统的成本可能高昂，特别是对于需要大样本量的研究。此外，对于嗜酸性粒细胞计数低的样本（如健康个体的外周血），通常需要预富集步骤（如密度梯度离心），以确保下游应用有足够的产量。
6.3 荧光激活细胞分选
FACS是分离嗜酸性粒细胞最精确的方法之一，利用其独特的物理和分子特性实现高纯度。嗜酸性粒细胞在FACS中可通过其大小、颗粒度以及特定表面标志物的表达来识别。FACS可实现超过98%的纯度，使其成为细胞培养和功能测定等应用的理想选择。在组织来源的样本中，FASC有效将嗜酸性粒细胞与巨噬细胞和其他免疫细胞分离，促进嗜酸性粒细胞在炎症、组织重塑和稳态中的特异性作用研究。尽管有其优点，FACS也带来挑战。专门的流式细胞仪昂贵且需要专业技术。样品制备，特别是来自组织的样品，通常涉及酶消化以释放细胞，这可能是劳动密集型的，如果处理不当可能损害细胞活力。此外，分选过程中长时间的处理或抗体结合可能激活嗜酸性粒细胞，改变其功能特性。FACS可以实现非常高的嗜酸性粒细胞纯度，通常高于95%–98%，这对于需要高度富集群体的应用是有利的。然而，最近的数据表明剪切应力和分选条件可以改变嗜酸性粒细胞转录谱，因此将FACS用于转录组分析需要谨慎和仔细优化。在保留天然基因表达至关重要的情况下，更温和的富集策略或低压分选方法可能更可取，尽管产量略低。FACS技术的最新进展，如光谱流式细胞术，允许同时使用更多标志物，提高了嗜酸性粒细胞分离的精确度和灵活性。自动化样品处理和改进的荧光染料简化了工作流程，使FACS更适合高通量研究。值得注意的是，嗜酸性粒细胞由于其颗粒而表现出高自发荧光，这可以作为抗体分选的具有成本效益的替代方案。这种自发荧光有助于以高达99%的纯度分离嗜酸性粒细胞，简化了分选过程并减少了对荧光抗体的依赖。
7 功能研究
嗜酸性粒细胞在各种生理和病理过程中是关键参与者，包括宿主防御、组织重塑和免疫调节。嗜酸性粒细胞的功能测定提供了对其活性的关键见解，有助于阐明其在健康和疾病中的作用。这些测定提供了对嗜酸性粒细胞介导的机制的重要见解，并有助于开发靶向嗜酸性粒细胞疾病的治疗策略。表2说明了研究嗜酸性粒细胞功能的几种有用技术之一。此外，还讨论了许多功能测定，重点在于其独特的应用和缺陷。
7.1 嗜酸性粒细胞迁移与趋化性
嗜酸性粒细胞迁移和趋化性受涉及趋化因子、受体和细胞内信号通路的多种分子机制调控。趋化因子CCL26（eotaxin-3）通过结合CCR3受体并与作为共受体的硫酸乙酰肝素等糖胺聚糖相互作用，在嗜酸性粒细胞趋化性中起关键作用，增强迁移；破坏这些相互作用会减少趋化性。维生素D可通过ERK信号通路抑制糖酵解诱导的CCL26表达，从而抑制嗜酸性粒细胞趋化性，提示在炎症性疾病中代谢调节嗜酸性粒细胞募集。组胺通过H1 和H2 受体调节嗜酸性粒细胞迁移，H2 受体激活增加细胞内cAMP并抑制趋化性，而H1 受体激活增强迁移，指示受体对嗜酸性粒细胞运动的特异性效应。细胞内钙梯度对嗜酸性粒细胞极化和定向迁移至关重要，前沿较低的钙浓度促进运动。此外，丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的激活对 eotaxin 诱导的嗜酸性粒细胞迁移至关重要，因为MAPK抑制破坏了趋化性所需的细胞骨架重排。细胞因子如GM-CSF和IL-3通过增强或抑制对各种趋化剂的反应来调节嗜酸性粒细胞趋化性，突出了嗜酸性粒细胞迁移调控的复杂性。
7.2 脱颗粒
嗜酸性粒细胞脱颗粒涉及毒性颗粒蛋白的释放，如嗜酸性粒细胞衍生神经毒素（EDN）、主要碱性蛋白和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，这些蛋白在过敏和寄生虫感染等条件下有助于免疫防御和组织损伤。脱颗粒测定通常测量EDN释放，常使用IgA或IgG包被的珠子刺激嗜酸性粒细胞，其中分泌型IgA是特别有效的触发因素。细胞因子如IL-5、GM-CSF和IL-3增强Ig诱导的脱颗粒，而IFN-γ可抑制它，指示细胞因子对嗜酸性粒细胞效应器功能的调节。通过CCR3受体起作用的趋化因子也诱导嗜酸性粒细胞脱颗粒，突出了CCR3作为嗜酸性粒细胞炎症中的关键介质。不同的脱颗粒模式包括经典胞吐、零碎脱颗粒和细胞溶解，其中细胞溶解性脱颗粒由纤维蛋白原通过CD11b依赖性粘附特异性触发，导致细胞死亡和膜结合颗粒的释放。血清中EDN的自动化测定为临床环境中嗜酸性粒细胞激活提供了可靠的生物标志物，尽管嗜酸性粒细胞计数和EDN水平之间存在个体差异。
嗜酸性粒细胞脱颗粒通过几种不同的机制发生。经典胞吐涉及颗粒膜与质膜融合，释放整个颗粒内容物到细胞外；复合胞吐特征是在分泌前多个颗粒融合，放大释放。零碎脱颗粒通过小囊泡选择性运输颗粒蛋白到质膜，在慢性炎症性疾病如哮喘和嗜酸性粒细胞性食管炎中尤其显著。细胞溶解，或胞外陷阱细胞死亡（ETosis），导致嗜酸性粒细胞裂解和完整颗粒及DNA陷阱的释放，促成持续性炎症和组织损伤。脱颗粒可由各种刺激触发，包括IgA和IgG抗体，其中分泌型IgA是有效的诱导剂，细胞因子如IL-5和GM-CSF增强这种反应，而IFN-γ可抑制它。粘附分子如CD11b/CD18在嗜酸性粒细胞与靶细胞（包括肿瘤细胞）相互作用期间的极化脱颗粒中起关键作用，促进细胞毒性蛋白的靶向释放。此外，血小板活化因子（PAF）和相关磷脂通过独立于经典PAF受体的机制诱导嗜酸性粒细胞脱颗粒，提示替代信号通路。
7.3 凋亡
嗜酸性粒细胞凋亡，一种程序性细胞死亡形式，对于调节嗜酸性粒细胞寿命和防止过敏性和炎症性疾病中 prolonged 组织损伤至关重要。测量嗜酸性粒细胞凋亡的测定常使用流式细胞术检测DNA碎片化、磷脂酰丝氨酸外露和线粒体变化，提供对细胞活力和死亡通路的见解。在哮喘中，嗜酸性粒细胞凋亡被延迟，部分原因是来自细胞因子如GM-CSF、IL-5和IL-3的存活信号，而皮质类固醇和地塞米松等药物促进凋亡并帮助解决炎症。嗜酸性粒细胞凋亡受内在和外在通路调控。内在通路涉及线粒体功能障碍，其中细胞色素c的释放激活caspase-9，随后激活caspase-3，Bcl-2家族蛋白如抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bax控制线粒体膜完整性。外在通路由死亡受体如Fas（CD95）和TRAIL受体触发，这些受体在结合其配体FasL或TRAIL时激活caspase-8，启动凋亡级联反应，皮质类固醇可增强这种Fas介导的通路，促进巨噬细胞对嗜酸性粒细胞的清除。这些通路可以相互作用，因为外在通路中caspase-8的激活可通过Bid激活和Bax易位放大线粒体损 伤 ， 增 强 凋
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