多浸没斜平面显微镜（miOPM）：面向高分辨光片荧光显微成像的可重构平台

光片荧光显微技术（Light-sheet fluorescence microscopy, LSFM）可实现生物样品温和、快速且高效的三维体成像。尽管潜力巨大，LSFM 已碎片化为多种变体，各自仅针对特定样品或成像区间优化，限制了广泛适用性。本研究研究人员提出多浸没斜平面显微镜（multi-immersion oblique plane microscope, miOPM），一种可适配从高分辨亚细胞动态到全生物个体及透明化组织成像的 LSFM 平台。miOPM 支持油、水、空气物镜无缝互换，并在折射率 1.33 至 1.51 范围内保持衍射极限性能；兼容标准样品装载、现有透明化方案及高通量 3D 成像。研究人员利用 miOPM 在多个空间尺度上成像多样生物样品。通过提升 LSFM 的适应性与易用性，miOPM 有望推动先进 3D 成像的普及化。

研究背景方面，光片荧光显微技术（Light-sheet fluorescence microscopy, LSFM）凭借温和、高速体成像能力成为重要荧光显微技术，可用于亚细胞动态、小动物活体及透明化小鼠与人组织全量成像。然而 LSFM 广泛推广受限于适应性与通用性不足：高分辨变体如晶格光片显微技术（lattice light-sheet microscopy, LLSM）与场合成需定制照明与探测物镜，正交几何限制集光立体角且物镜难更换；全胚胎与透明化组织又需不同专用系统；多尺度系统常牺牲活体成像或样品通用性。斜平面显微技术（oblique plane microscopy, OPM）虽单物镜共路照明探测，但传统上更换主物镜需重建整条下游光路。因此核心设施与实验室常需多台专用仪器。为此，研究人员开展多浸没斜平面显微镜（miOPM）研究，基于任意浸没远程调焦（Any immersion remote refocus, AIRR）框架，使同有效焦距不同浸没物镜可自由互换，并用变倍镜头连续适配样品折射率，结论是单台系统即可在油、水、空气及透明化介质中保持衍射极限性能并覆盖亚细胞到组织尺度，意义重大在于降低先进 LSFM 使用门槛，论文发表于《Nature Methods》。

关键技术方法上，研究人员采用两台 miOPM 系统，分别位于 UT Southwestern Medical Center 与 Calico Life Sciences；以 Nikon ×40 同有效焦距空气（NA 0.95）、水（NA 1.15）、硅油（NA 1.25）与油（NA 1.30/1.3）物镜族为主物镜，二次物镜构成远程调焦，三次成像系统接 sCMOS；引入三群组变倍镜头固定前后焦面实现 1.33–1.51 放大率连续调节；用振镜进行图像空间扫描与光片耦合；样品涵盖固定细胞、HeLa 与 U-2 OS 细胞、CD8⁺ T 细胞、原代小鼠纹状体神经元培养于孔膜碳支持金 EM 栅、肺泡类器官来自成年 C57BL6/J 小鼠、扩张肝切片、CLARITY 透明化小鼠脑切片及 Chaos carolinensis 变形虫，并做 384 孔板高通量成像。

研究结果部分， Foundations of multi-immersion oblique plane microscopy 中，研究人员推导 AIRR：主、次物镜形成无畸变衍射极限远程像，横向放大率应等于样品折射率与次物镜空间折射率之比，样品空间角度同映射到远程空间；变倍镜头免重建光路即可连续匹配折射率，从而避免轴向非线性畸变，支持透明化方案。

Sensitive, high-resolution imaging with an oil objective 中，油浸 ×40 NA 1.3 下研究人员成像 α-eGFP adaptin 标记网格蛋白包被坑，图像去相关估得侧向分辨约 254±17 nm；对 CD8⁺ T 细胞 CellMask Orange 膜标记以 1 s 体速率拍 300 时间点捕获微绒毛形成动态；HeLa 细胞 MitoTracker Red 与 PicoGreen 标线粒体 DNA 可分辨线粒体及 mtDNA 点状物并观察裂变分离，说明油物镜适合敏感受损低的亚细胞动态。

Water objective for imaging extended samples 中，水浸 ×40 NA 1.15 下扩张 4.05 倍肝切片以 SYTOX Green 标染色质，垂直拼接 11 个体积达约 609 µm，等效 x/y/z 非去卷积分辨约 91/83/221 nm，可分割核与核仁；肺泡 AT2 类器官多重免疫标记显示 AT2、AT1、线粒体与核；原代神经元长膜 MemGlow-488 与 αSyn-647 预成纤维种，荧光定位轴突 puncture 后冷冻电镜相关成像证实物对应神经突内纤维聚集体，体现水物镜对厚样品与相关光电子显微（CLEM）的适配。

Air objective for contact-less large volume imaging 中，空气 ×40 NA 0.95 具最大远程调焦高度，非机械拼接光学扫描获约 130 µm 栈，可辨 U-2 OS 细胞器、扩张肝癌组织线粒体亚结构及核仁；变形虫 Lifeact–GFP2 显示 uropod 液泡；SU8686 细胞在胶原矩阵中迁移 3 h 观测；384 孔四色接触式无浸没成像证明空气物镜适于蒸发/液面扰动敏感的高通量筛选。

Adapting miOPM to cleared tissue imaging 中，硅油 ×40 NA 1.25 配变倍镜头：折射率 1.47 微通道珠样在放大 1.33 时顶部球差退化，调至 1.47 恢复衍射极限；CLARITY 小鼠脑 Thy1–eGFP 在 1.33 时深层细节模糊，1.47 时棘突等细结构在 x–y 与轴截面可辨，证明变倍镜头按折射率调放大率是透明化组织高分辨关键。

讨论部分总结，研究人员指出 miOPM 打破高 NA OPM 只适贴壁细胞、中 NA OPM 只适大体积的割裂：换主物镜即可权衡分辨、灵敏度与体积；空气物镜边缘案例支持无浸没多孔与低温光学成像；CLEM 桥接 α-synuclein 种入活细胞与人 Lewy 小体超微病理；油物镜模式性能可比 LLSM，但 OPM 振镜扫描潜在更快、LLSM 探测光效更高，LLSM 受水相专用物镜限制而 miOPM 可非水透明化；变倍镜头连续覆 1.33–1.51 优于校正环局部修正，均质折射率假设下 AIRR 有效，空间变异折射率需自适应光学（adaptive optics, AO）。miOPM 为重定义 OPM 标准与核心设施普及高分辨 LSFM 提供蓝图。

结论部分翻译：研究人员提出 miOPM，一个可在分辨率、灵敏度、体覆盖与样品折射率方面适配成像需求的光片平台。这与先前高分辨 OPM 系统形成对照，后者擅长贴壁细胞却弱于大样品。通过统一通用性与简洁性，研究人员预期 miOPM 将重定义 OPM 平台的标准配置。除直接应用外，miOPM 为未来可适配、可获取、广泛部署的光片技术——即便在需求多样的核心设施环境中——确立蓝图。该框架将加速高分辨 LSFM 的普及化。