细胞因子微环境塑造肿瘤相关成纤维细胞的抗原提呈与基质重塑功能状态

肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）展现出显著的功能异质性，在多种恶性肿瘤中均观察到保守的亚型。然而，它们在塑造肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的共同作用及其动态可塑性仍未完全阐明。本研究通过整合四种癌症类型的单细胞和空间转录组学分析，鉴定出两种不同的免疫调节性CAF状态，分别称为抗原提呈CAFs（antigen-presenting CAFs，apCAFs）和基质产生CAFs（matrix-producing CAFs，mCAFs）。在多种实体瘤中，apCAFs与增强的抗肿瘤免疫特征和良好预后相关，而mCAFs则与免疫抑制特征和较差的临床结局相关。空间分析揭示了apCAFs和mCAFs在TME内的不同定位模式。在功能上，患者来源的apCAFs促进T细胞迁移、增殖和活化，而mCAFs在体外抑制这些反应。泛癌分析进一步揭示了肿瘤组织中apCAF与mCAF丰度之间的强烈负相关。在机制上，IFN-γ和TGF-β相关的信号环境与不同的CAF转录程序相关联，其中IFN-γ促进apCAF相关特征，而TGF-β倾向于mCAF相关特征，提示细胞因子环境在塑造CAF状态异质性中的潜在作用。在临床上，apCAFs与良好的免疫治疗反应相关，而mCAFs预测较差的治疗结局。综上所述，这些发现鉴定了跨癌症保守的免疫调节性CAF亚型，揭示了不同的细胞因子相关CAF程序，并支持将基质重编程作为增强免疫治疗疗效的有前景策略。

一、研究背景与科学问题

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）由癌细胞、免疫细胞和基质细胞组成，它们动态相互作用以影响肿瘤进展和治疗反应。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）作为基质成分中的关键调节者，在肿瘤生长、治疗抵抗和免疫调节中发挥重要作用。尽管CAF异质性日益受到重视，某些亚型在多种癌症中保守存在，但它们在TME中的具体作用仍未完全阐明。高通量单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术的出现极大地推动了CAF异质性表征，但关键挑战仍然存在，包括系统评估CAF亚型在肿瘤中的免疫调节功能以及CAF亚型间的相互调控关系。此前研究虽已鉴定出多种CAF亚型，如表达MHC class II的CAFs、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑型CAFs等，但缺乏跨癌种的系统整合分析，且对CAF亚型如何被TME中的细胞因子环境塑造和调控知之甚少。基于此，研究人员开展了本研究，旨在整合多种癌症类型的单细胞和空间转录组数据，鉴定保守的免疫调节性CAF亚型，解析其功能、空间定位、可塑性及其临床意义，为克服基质介导的免疫治疗抵抗提供潜在策略。该论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

二、主要技术方法

研究人员整合了自产及公共scRNA-seq数据集，涵盖四种常见癌症类型（结直肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌），共72个样本来自42例患者，并匹配空间转录组（spatial transcriptomics，ST）分析。经过严格质控后保留409,917个单细胞和70,649个空间斑点。利用无监督聚类和经典标记基因鉴定细胞类型，提取28,224个成纤维细胞进行整合再聚类。采用AUCell和基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）评估亚型功能特征。利用CIBERSORTx算法基于单细胞数据推断CAF亚型丰度，采用单样本基因集富集分析（single-sample Gene Set Enrichment Analysis，ssGSEA）计算TME功能基因签名。空间分析使用Robust Cell Type Decomposition（RCTD）进行细胞类型反卷积和邻域鉴定。通过多重免疫组化（multiplex immunohistochemistry，mIHC）和组织微阵列（tissue microarray，TMA）队列验证空间分布。利用SCENIC分析转录因子调控网络，通过Monocle进行拟时序轨迹分析。体外实验包括患者来源CAF分选、T细胞迁移/增殖/活化共培养实验、流式细胞术、免疫印迹、定量实时PCR及bulk RNA-seq。小鼠MC38肿瘤模型用于验证IFN-γ诱导的apCAF样成纤维细胞联合抗PD-L1治疗的疗效。

三、主要研究结果

CAFs跨癌症的单细胞图谱解析

研究人员整合四种癌症类型的scRNA-seq数据，鉴定出八种不同的成纤维细胞亚型，包括正常成纤维细胞（normal fibroblast，NF）、平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）、telocytes以及五种CAF亚型：抗原提呈CAFs（antigen-presenting CAFs，apCAF）、基质产生CAFs（matrix-producing CAFs，mCAF）、脂肪生成CAFs（adiCAF）、外周神经样CAFs（pnCAF）和血管CAFs（vasCAF）。mCAF亚型高表达ECM相关基因，包括MMP11、多种胶原蛋白基因（COL10A1、COL11A1、COL8A1、COL12A1、COL5A2）以及COMP和POSTN等非胶原基质蛋白，同时高表达FAP和TGFB1等免疫调节相关基因。apCAF亚型高表达MHC class II基因（HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74），但缺乏经典共刺激分子。功能分析显示adiCAF富集脂质相关通路，apCAF在免疫调节功能中活性最高，mCAF富集ECM合成和调节通路，vasCAF富集血管生成通路，pnCAF富集神经元信号转导通路。肿瘤组织中NF比例显著降低，而mCAF和vasCAF比例显著升高。

鉴定与抗肿瘤免疫相关的CAF亚型

通过TCGA数据分析CAF亚型丰度与TME签名的相关性，发现apCAF丰度与抗肿瘤微环境相关功能基因签名（包括T细胞转运、Th1反应、效应细胞功能、NK细胞以及MHC class II和class I表达）呈正相关，与血管生成、纤维化和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关签名呈负相关。相反，mCAF丰度与抗肿瘤微环境签名负相关，与血管生成、纤维化和EMT正相关。在结直肠癌共识分子亚型（Consensus Molecular Subtypes，CMS）分析中，apCAF富集于免疫浸润型CMS1亚型，mCAF富集于间质型CMS4亚型。CIBERSORTx定量分析显示apCAF与多种抗肿瘤淋巴细胞（CD4⁺记忆活化T细胞、CD8⁺T细胞、活化NK细胞）正相关，mCAF则负相关。泛癌分析一致显示apCAF与抗肿瘤淋巴细胞正相关，mCAF负相关。预后分析显示mCAF与较差的患者结局相关，apCAF与改善的生存相关，其中apCAF/mCAF比值在多种癌症类型中表现出最强的预后相关性。

apCAFs和mCAFs在TME中与T细胞的不同空间和功能关联

空间转录组分析显示apCAF高肿瘤表现出CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润增加并与apCAF空间共定位，而mCAF高肿瘤T细胞浸润显著减少。RCTD邻域分析显示apCAF主要被T细胞和其他apCAF包围，而mCAF主要邻近肿瘤细胞和其他mCAF，T细胞比例较低。mIHC和TMA队列验证证实apCAF常被丰富的CD4⁺和CD8⁺T细胞包围，mCAF富集的基质区域T细胞浸润显著减少。定量相关性分析确认apCAF丰度与CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润正相关，mCAF负相关。

CAF亚型相关的T细胞浸润和活化差异

apCAF高表达CCL4和CCL5等趋化因子，配体-受体相互作用分析显示apCAF与T细胞间的配体富集于T细胞增殖、迁移和活化调控相关GO条目。空间共表达分析证实CCL5-CCR5、MHC II-CD4、CCL4-CCR5和CCL19-CCR7等配体-受体对在apCAF富集区域高度共定位。患者来源apCAF促进T细胞迁移，高HLA-DR表达的apCAF表现出增强的抗原摄取能力，共培养后T细胞表达TNF-α、IFN-γ和granzyme B等细胞毒性分子增加并伴随增殖增加。mCAF与T细胞间的相互作用涉及ECM组分与CD44的互作，空间共定位分析支持该配体-受体对。mCAF与T细胞空间分离，可能形成物理屏障阻碍T细胞浸润。患者来源mCAF减少T细胞迁移并抑制其增殖和活化。

apCAFs与mCAFs在泛癌TME中呈负相关

TCGA四种癌症类型及泛癌分析均显示apCAF和mCAF丰度之间存在强烈负相关。自产scRNA-seq验证队列中apCAF频率与mCAF频率负相关（R=−0.4），多癌种TMA队列中同样观察到负相关。ST样本中apCAF评分与mCAF评分呈负相关，RCTD分析进一步确认空间斑点内两种亚型频率负相关。邻域定量分析显示apCAF邻近区域仅少量mCAF，mCAF邻近区域也罕见apCAF，表明两种亚型具有不同的空间分布模式。

IFN-γ和TGF-β信号与apCAF和mCAF状态的不同关联

SCENIC分析鉴定IRF1和IRF8在apCAF中选择性活化，而CREB3L1在mCAF中选择性活化。拟时序轨迹分析显示从NF出发的两条不同活化通路。基因集评分显示apCAF表现出更强的IFN-γ响应信号，mCAF表现出增强的TGF-β响应信号。体外验证显示IFN-γ刺激患者来源CAF显著上调MHC II分子，TGF-β处理减弱IFN-γ诱导的上调。TGF-β诱导FAP表达显著增加，IFN-γ共处理可减轻该效应。IFN-γ抑制TGF-β诱导的ECM相关基因在mRNA和蛋白水平的表达。TCGA-SKCM队列中IFN-γ响应评分在apCAF高组较高、mCAF高组较低，TGF-β响应则相反。相关性分析确认IFN-γ响应签名与apCAF频率正相关、与mCAF频率负相关，TGF-β响应则相反。bulk RNA-seq GSEA验证IFN-γ富集apCAF签名和免疫调节相关通路，TGF-β富集mCAF签名和ECM组织相关通路。

apCAF和mCAF丰度与免疫治疗反应相关

在黑色素瘤和尿路上皮癌免疫治疗队列中，高apCAF丰度患者ICB治疗反应率显著更高，高mCAF组反应率较低。应答者肿瘤中apCAF水平较高、mCAF水平较低。高apCAF/mCAF比值患者在SKCM和UC两个ICB治疗队列中总生存期延长。医院结直肠癌免疫治疗患者验证显示应答者apCAF丰度更高。空间分析显示apCAF富集微环境邻近的肿瘤细胞富集于抗原加工提呈、IFN-γ介导信号、适应性免疫应答等免疫相关通路，而mCAF富集微环境邻近的肿瘤细胞富集于ECM组织、胶原纤维形成和细胞-基质黏附等通路。小鼠MC38模型中，IFN-γ刺激的成纤维细胞联合抗PD-L1治疗表现出最佳治疗反应，增强CD3⁺T细胞和效应CD8⁺T细胞浸润并减少CD4⁺Treg浸润。

四、讨论与结论

本研究全面分析了CAF异质性，强调其免疫调节特征和状态可塑性。通过整合多种恶性肿瘤的单细胞和bulk RNA-seq数据，鉴定出保守的免疫调节性CAF亚型，并发现不同细胞因子环境与apCAF和mCAF状态相关。apCAFs虽表达MHC class II分子但缺乏经典共刺激分子，其精确功能作用此前存在争议。本研究发现apCAF与活化CD8⁺T细胞一致相关，但与Tregs无显著相关，提示apCAF与免疫活跃的TME相关。apCAF保留抗原加工和提呈能力，尽管缺乏经典共刺激信号。mCAF与肌成纤维细胞样CAF亚群高度相似，参与限制T细胞浸润和损害抗肿瘤免疫反应。研究提出IFN-γ/TGF-β介导的apCAF和mCAF状态之间的调节轴，IFN-γ促进apCAF相关特征并减少mCAF样程序，部分抵消TGF-β的作用；TGF-β主要由mCAF表达，与mCAF样程序相关并减少apCAF相关特征。临床分析表明apCAF与良好免疫治疗反应相关，mCAF预测较差治疗结局。小鼠模型中IFN-γ诱导的apCAF样成纤维细胞增强抗肿瘤免疫反应并改善抗PD-L1疗效。研究结论支持将基质重编程作为增强免疫检查点阻断治疗疗效的有前景策略，为克服基质介导的免疫治疗抵抗提供了新思路。