脆弱拟杆菌外膜囊泡递送靶向IL-1β单链抗体缓解慢性肾脏病肾小管炎症的研究

本研究创新性地利用非致病性共生菌脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）来源的外膜囊泡（OMV）作为递送载体，装载抗IL-1β单链可变区片段（scFv），并偶联肾脏靶向肽（KKEEE）3K，构建了新型纳米药物OMV-(KKEEE)3K-scFv。该药物在多种慢性肾脏病（CKD）模型（糖尿病肾病、狼疮性肾炎、单侧输尿管梗阻）中均展现出卓越的靶向性、安全性和抗炎疗效，能精准富集于近端肾小管，通过抑制NF-κB通路降低TNF-α、IL-6、MCP-1等炎症因子表达，减轻肾小管炎症和损伤，为CKD的靶向治疗提供了新策略。

1 引言

慢性肾脏病（CKD）影响全球10%–15%的成年人，持续性慢性炎症是推动其发生发展的关键因素。白细胞介素-1β（IL-1β）在多种实验性和人类肾脏疾病中扮演核心角色，然而，现有的抗IL-1β抗体疗法面临系统性副作用和生产成本高昂等瓶颈，限制了其在CKD治疗中的应用。外膜囊泡（OMV）是革兰氏阴性菌天然分泌的脂质双层纳米结构，具有生物分子递送和特定组织靶向能力。本研究选用非致病性共生菌脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）来源的OMV（BF-OMV）作为药物载体，其脂多糖（LPS）内毒素活性较低，免疫原性弱。为解决肾脏靶向难题，研究者将肾脏靶向肽（KKEEE）₃K偶联至OMV表面，并装载更易生产、分子量更小的抗IL-1β单链可变区片段（scFv），构建了新型纳米药物OMV-(KKEEE)₃K-scFv，旨在增强药物在肾脏的富集，提高治疗效率和安全性。

2 材料与方法

通过基因工程技术在^E. ^coliT7表达系统中成功表达并纯化了分子量约为28 kDa的重组IL-1β scFv，其具有良好的中和活性和对人、鼠IL-1β的高亲和力。从脆弱拟杆菌NCTC9343菌株的培养上清中通过超速离心法提取OMV，并通过超声加载scFv，利用无铜点击化学反应将（KKEEE）₃K肽偶联到OMV表面，形成OMV-(KKEEE)₃K-scFv。对制备的纳米颗粒进行了形貌、粒径、电位、载药效率、纯度、无菌及内毒素含量等多方面的质量控制。在体外高葡萄糖（HG）诱导的小鼠原代肾小管上皮细胞（PTECs）炎症模型以及链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病（DN）小鼠模型、MRL/lpr狼疮性肾炎（LN）小鼠模型和单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型中，系统评估了OMV-(KKEEE)₃K-scFv的安全性、药代动力学、生物分布及其抗炎和肾脏保护功效。

3 结果

3.1 OMV-(KKEEE)₃K-scFv的制备与表征

成功构建的OMV-(KKEEE)₃K-scFv纳米颗粒呈现典型的双层膜结构，粒径均一，稳定性好。不同批次制备的纳米颗粒在形貌、粒径、膜电位、载药效率（约22.6%）和（KKEEE）₃K偶联量方面具有良好的一致性。蛋白组学分析显示不同批次OMV的蛋白组成高度相似。螯试剂（LAL）检测表明所有制剂的内毒素水平均低于安全阈值。

3.2 安全性评估

体外细胞毒性实验（CCK-8）显示，治疗剂量（8.7 × 10⁸particles/mL）的OMV-(KKEEE)₃K-scFv对PTECs的活力无影响，且未引起IL-1β、TNF-α等炎症因子表达升高。与^E. ^coli来源的OMV（EC-OMV）相比，BF-OMV表现出更低的细胞毒性和免疫刺激性。体内长期毒性实验（2个月）表明，健康小鼠静脉注射OMV-(KKEEE)₃K-scFv后，主要脏器（心、肝、脾、肾）病理学未见异常，血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）以及炎症细胞因子（IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4）水平均在正常范围内，证明了其良好的生物相容性。

3.3 组分功效验证

通过UUO模型验证了各组分功能的必要性。结果显示，单独的OMV、scFv、OMV-(KKEEE)₃K或OMV-scFv均未能显著改善肾脏损伤和炎症；只有完整的OMV-(KKEEE)₃K-scFv系统才能有效降低肾小管间质损伤评分、纤维化评分、CD68⁺炎症细胞浸润以及肾脏MCP-1、TNF-α、IL-6的表达，证实了OMV递送、（KKEEE）₃K靶向和scFv中和功能的协同作用不可或缺。

3.4 体外抗炎功效

在高葡萄糖诱导的PTECs炎症模型中，（KKEEE）₃K修饰显著增强了OMV的细胞摄取。OMV-(KKEEE)₃K-scFv处理能显著降低HG诱导的TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白表达水平，抑制NF-κB通路关键蛋白磷酸化p65（p-p65）的表达，并减少细胞培养上清中IL-1β的分泌。

3.5 体内药代动力学与生物分布

体外释放实验表明OMV-(KKEEE)₃K-scFv能实现scFv的缓释。在DN小鼠模型中，与游离scFv相比，OMV-(KKEEE)₃K-scFv显著延长了scFv在血液中的循环时间，并大幅提高了scFv在肾脏组织的蓄积浓度，且在注射后48小时仍能在肾脏检测到较高水平的scFv。活体成像显示OMV-(KKEEE)₃K-scFv在肾脏的荧光信号显著强于未修饰的OMV，且主要富集在病变侧肾脏。免疫荧光染色证实scFv与肾小管细胞标志物megalin共定位，说明其通过megalin受体介导的内吞作用进入肾小管细胞。

3.6 体内治疗效果

在STZ诱导的DN小鼠模型中，OMV-(KKEEE)₃K-scFv治疗能显著改善肾小管形态，减轻肾间质纤维化和肾小管基底膜增厚，降低尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子-1（Kim-1）水平和尿白蛋白/肌酐比值（ACR），但对血糖和体重无影响。同时，治疗组肾脏CD68⁺炎症细胞浸润和MCP-1表达减少，TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平下降，NF-κB通路活化被抑制，血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平也显著降低。

在LN和UUO小鼠模型中，OMV-(KKEEE)₃K-scFv同样表现出显著的抗炎和肾脏保护作用，能够减轻肾小管间质炎症细胞浸润、纤维化程度，降低肾脏炎症因子表达和血清炎症指标。

4 讨论

本研究首次成功利用益生菌来源的OMV作为递送载体，构建了靶向肾脏的抗IL-1β纳米药物OMV-(KKEEE)₃K-scFv。该系统巧妙结合了BF-OMV的低免疫原性和生物相容性、（KKEEE）₃K肽的肾脏靶向能力以及scFv对IL-1β的高效中和作用，实现了药物在肾脏病变部位的精准递送和持续释放。其在DN、LN、UUO三种不同病因的CKD模型中均能有效缓解肾小管炎症和损伤，作用机制与抑制IL-1β/NF-κB信号通路密切相关。该研究为开发针对CKD及其他器官特异性炎症疾病的靶向疗法提供了新思路和实验依据，展示了细菌OMV作为新型药物递送平台的巨大应用潜力。未来研究可进一步优化OMV的尺寸和表面修饰，以减少非靶器官积累，并探索长期给药的免疫应答问题。