在我们身体的皮肤表面，存在着一种特殊的触觉感受器——Merkel细胞（Merkel cells, MCs）。这些位于皮肤基底层的神经内分泌细胞，就像微小的传感器，负责感知轻触觉刺激。然而，科学家们对这类细胞在发育成熟过程中，其基因表达调控的精细机制仍知之甚少。特别是在真核生物中，基因转录和转录后加工（如选择性剪接）能产生多种RNA类型，包括蛋白编码和非编码转录本。这些非编码RNA是否在细胞命运决定中扮演重要角色，是一个亟待探索的前沿问题。
传统上，对细胞分化的研究多聚焦于蛋白编码基因的表达变化。但随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展，尤其是能够捕获全长转录本的SMART（Switching Mechanism at the 5′ end of RNA Template）技术，使得在单细胞水平深入解析转录本多样性成为可能。这为揭示细胞分化过程中非编码RNA的动态变化及其功能提供了前所未有的机会。
为了填补这一空白，研究人员将目光投向了Merkel细胞的发育过程。他们假设，在Merkel细胞走向终末分化的过程中，非编码RNA可能发挥着关键的调控作用。为了验证这一假设，研究团队开展了一项系统的研究，其成果发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》期刊上。
主要关键技术方法
本研究综合利用多种前沿技术。研究人员从携带GFP/+ 和GFP/+ 报告基因的小鼠中，通过荧光激活细胞分选术（FACS）在不同发育时间点（胚胎期E16.5, E17.5, E18.5，新生期P0，出生后P6）分离Merkel细胞。利用Smart-seq2方法构建单细胞全长cDNA文库并进行深度测序。采用STAR进行转录本比对，RSEM进行定量，Monocle进行伪时间轨迹分析。通过单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）进行空间定位验证，并利用HT-22细胞系进行功能获得性实验。此外，还分析了多个公共scRNA-seq数据集（包括小鼠肺AT2细胞、人类神经元、小鼠神经元/肌细胞、小鼠生长板等）以及长读长单核RNA测序数据，并研究了唐氏综合征患者来源的神经元数据。
FACS-based scRNA-seq identifies trajectory for mouse MC differentiation
通过基于FACS的单细胞RNA测序，研究人员成功获得了698个高质量的小鼠Merkel细胞转录组。利用Monocle进行伪时间轨迹分析，构建了Merkel细胞分化的连续路径。分析显示，祖细胞标志物如
, , 的表达在分化早期迅速下降，而分化标志物如, , 的表达则随轨迹增加，成熟Merkel细胞基因如, , 在轨迹后期高表达。这证实了伪时间轨迹可准确反映Merkel细胞的体内分化过程。 MC terminal differentiation is accompanied by the emergence of non-protein coding transcript biotypes associated with functionally relevant genes
对全长转录本的深入分析发现，在Merkel细胞终末分化过程中，动态表达的转录本可聚类为5种模式。特别值得注意的是，在完全分化的Merkel细胞中高表达的转录本（簇5）中，蛋白编码转录本的比例（51.4%）显著低于其他簇和全局平均水平，而非编码转录本（特别是保留内含子Retained Intron, RI、长链非编码RNA lncRNA和 nonsense-mediated decay NMD转录本）的比例相对富集。基因本体（GO）富集分析显示，这些在分化晚期出现的非编码转录本所关联的基因，显著富集于神经元分化和功能相关通路，提示它们对Merkel细胞神经感觉功能的调控具有重要意义。
Retained intron transcripts can form extrachromosomal nuclear condensates
研究人员重点关注了富集的非编码转录本之一——保留内含子（RI）转录本。以
基因（编码天冬氨酸酰化酶aspartoacylase）为例，其转录本-201（mRNA）和-202（RI）在单个Merkel细胞内共表达，且表达量随分化进程增加。单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）证实， RI转录本在细胞核内形成染色体外核凝聚体（extrachromosomal nuclear condensates），并且常常与同源的 mRNA转录本共定位。在更成熟的外触觉圆顶（outer touch dome）Merkel细胞中，这种共定位更为显著。对另一个基因的观察也得到类似结果。 Retained intron transcripts can induce nuclear retention of mRNA and downregulate protein expression
为了探究RI转录本的功能，研究团队在可体外终末分化的HT-22神经元细胞系中进行了验证。发现HT-22细胞分化后，
RI表达增加，而 mRNA表达减少，且mRNA的胞质比例下降，ASPA蛋白水平显著降低（降低89.1%）。更重要的是，在未分化的HT-22细胞中过表达 RI转录本，足以模拟分化后的表型：增加核凝聚体形成，减少 mRNA的胞质分布和表达水平，并导致ASPA蛋白水平下降89.9%。这表明RI转录本通过形成核凝聚体隔离同源mRNA，阻止其核输出，从而负调控基因表达，这是一种新的转录后调控机制。 Emergence of non-protein coding RNA biotypes is a general feature of terminal differentiation
为了验证非编码转录本涌现是否是终末分化的普遍特征，研究人员分析了五种其他哺乳动物细胞类型的分化scRNA-seq数据（小鼠肺AT2细胞、人类神经元、小鼠神经元、小鼠肌细胞、小鼠生长板）。在所有细胞类型中，均在分化晚期高表达的转录本簇中观察到非编码生物型（特别是RI和lncRNA）的比例显著富集。GO分析显示，这些非编码转录本关联的基因均富集于相应细胞类型的功能相关通路。此外，对利用长读长单核RNA测序技术获得的C2C12成肌细胞分化数据的分析，也证实了终末分化阶段非编码RNA生物型的涌现。这表明非编码转录本的涌现是哺乳动物细胞终末分化的一个普遍特征。
The prominence of non-protein coding RNA biotypes is blunted in terminally differentiated Down syndrome neurons
神经发生异常是唐氏综合征（Down syndrome, DS）的特征之一。研究人员比较了由DS患者和健康对照诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来的神经元转录组数据。发现与对照组神经元相比，在DS神经元中特异性上调的差异表达（DE）转录本中，蛋白编码转录本的比例更高（73.5%），而非编码转录本的比例相对减少。GO分析显示，对照组神经元特异性上调的非编码转录本关联的基因富集于神经元分化和功能，而DS神经元中则缺乏这种富集。这表明在分化受损的DS神经元中，非编码转录本生物型的涌现被削弱，提示其与神经元成熟障碍相关。
研究结论与意义
本研究通过高深度的单细胞全长转录组测序，首次系统描绘了Merkel细胞终末分化过程中的转录本动态变化图谱，并揭示了一个先前未被重视的现象：非编码RNA生物型的涌现是细胞终末分化的一个普遍标志。研究不仅发现了这一规律，还深入阐释了其一种新型调控机制：RI转录本可通过形成核凝聚体，隔离同源mRNA，抑制其核输出，从而在转录后水平精细调控基因表达。
这项研究的创新性和重要意义在于：
1. 发现新规律： 明确了非编码转录本生物型（特别是RI、lncRNA、NMD）在多种细胞终末分化过程中的特异性富集，这为理解分化晚期基因表达调控提供了新视角。
2. 揭示新机制： 发现了RI转录本通过形成核凝聚体调控同源mRNA核滞留和蛋白表达的新机制，拓展了非编码RNA的功能范畴。
3. 关联人类疾病： 在唐氏综合征神经元模型中观察到非编码转录本涌现的减弱，提示该过程可能与神经发育疾病的病理机制相关。
4. 技术应用与验证： 结合FACS、Smart-seq2、smFISH、功能实验以及多组公共数据验证，结论坚实可靠。
5. 提出新范式： 研究提示，在终末分化、退出细胞周期的功能成熟细胞中，其基因表达调控可能更倾向于利用非编码转录本（如RI介导的核滞留）来精细维持功能相关蛋白的水平，而非快速大量合成。
总之，该研究深化了对细胞分化，特别是终末分化过程中转录组复杂性的认识，揭示了非编码RNA作为关键调控分子的重要作用，为相关发育生物学研究和疾病机制探索提供了新的理论基础和潜在靶点。
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