材料与方法
本研究整合了对三阴性乳腺癌（TNBC）患者队列的回顾性转录组数据分析，与利用肿瘤芯片（ToC）技术进行的离体功能实验，旨在揭示特定癌症相关成纤维细胞（CAF）亚群在驱动化疗耐药中的作用机制。具体来说，研究者利用SCANDARE研究（NCT03017573）收集的88例TNBC患者（52例化疗敏感，36例耐药）的114份肿瘤样本（78份治疗前，36份治疗后）的批量RNA测序数据，结合来自乳腺癌患者的高度解析的单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱作为参考，使用BayesPrism算法进行细胞组成反卷积分析，以评估不同细胞类型和状态（共39种）在化疗前后的比例变化。对于功能验证，研究者从乳腺癌患者手术样本中分离、扩增并利用流式细胞术（检测FAP+integrin β1+SDC1+LAMP5-表型）鉴定了原代ECM-myCAF，并将其与TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-436）在微流控芯片（AIM-Biotech DAX-1芯片）的3D胶原蛋白基质中共培养，构建了肿瘤芯片模型。细胞被以模拟体内观察到的比例（3.5:1，癌细胞：CAF）接种。利用活细胞成像技术（Leica DMi8显微镜），通过红色活细胞染料（CellTrace）标记癌细胞，绿色凋亡检测染料（CellEvent Caspase-3/7）监测凋亡，在给予多柔比星或紫杉醇化疗药物处理前后，对细胞存活与凋亡进行长达72小时的手动及自动化（使用STAMP算法）定量分析。此外，研究还通过从ToC中回收细胞进行scRNA-seq以验证细胞身份和探索分子机制，利用Transwell共培养体系进行蛋白质印迹分析以检测蛋白表达变化，并使用小干扰RNA（siRNA）对G0S2进行基因沉默，以及采用PamGene芯片技术进行多重激酶活性分析。统计分析在R或GraphPad Prism软件中完成。
结果
化疗后ECM-myCAF含量在化疗敏感而非耐药的TNBC患者中下降
通过对患者数据的反卷积分析发现，化疗后，化疗敏感患者的肿瘤微环境（TME）细胞组成发生显著改变，其中癌症相关成纤维细胞（CAF）整体比例增加，而癌细胞比例减少。进一步聚焦于CAF异质性，研究发现FAP+SMA+CAF是TNBC肿瘤中最丰富的成纤维细胞群。在对其进行单细胞亚群分析后，发现了一个关键的胞外基质生成性肌成纤维细胞（ECM-myCAF）亚群。该亚群在治疗前于化疗敏感和耐药患者肿瘤中均大量存在。然而，化疗后，仅在化疗敏感患者中观察到ECM-myCAF比例显著下降，同时伴随解毒型炎症性CAF的增加；而在化疗耐药患者中，ECM-myCAF的比例保持稳定且居高不下。这提示ECM-myCAF可能在TNBC化疗耐药中扮演关键角色。
原代ECM-myCAF在3D肿瘤芯片模型中保护TNBC细胞免受多柔比星和紫杉醇的杀伤
为了在功能上验证上述发现，研究者在肿瘤芯片中建立了3D共培养模型。通过scRNA-seq确认，从患者肿瘤分离并在ToC中培养的原代细胞仍高表达FAP+CAF和ECM-myCAF特征基因，保持了其身份特征。活细胞成像及定量分析表明，无论在有无化疗药物（多柔比星或紫杉醇）存在的情况下，ECM-myCAF的共培养都显著提高了MDA-MB-231和MDA-MB-436两种TNBC细胞系的存活率，并降低了其凋亡率。这种保护作用是ECM-myCAF特异的，因为另一种CAF亚群——癌症相关血管周围样成纤维细胞（CAP，或称CAF-S4）——并未表现出类似的保护效应。自动化STAMP算法分析进一步证实了这一稳健且可复现的化学保护作用。
“生命之吻”：ECM-myCAF的化学保护作用发生在早期且需要近距离接触
对ECM-myCAF自身对化疗反应的分析显示，不同患者来源的ECM-myCAF对多柔比星的敏感性存在异质性，有的高度敏感，有的则表现出耐药性。有趣的是，与TNBC细胞共培养可以保护ECM-myCAF自身免受多柔比星诱导的死亡，表明两者之间存在相互保护作用。紫杉醇则主要影响ECM-myCAF的运动和形态，但对它们的存活率影响较小。为了探究保护作用的机制，研究者分析了癌细胞与ECM-myCAF的空间相互作用。通过量化两者之间的接触次数、最小距离以及82微米半径范围内的交集面积，他们发现化疗压力下存活的癌细胞与ECM-myCAF的接触更为频繁和紧密。具体来说，与死亡的癌细胞相比，存活的癌细胞与ECM-myCAF的直接接触次数更多，且与最近的ECM-myCAF的最小距离更短。这表明ECM-myCAF对癌细胞的保护作用可能依赖于短距离的细胞间相互作用或旁分泌信号。
单细胞RNA测序揭示ECM-myCAF与TNBC细胞共培养诱导的转录组变化
为了在分子水平上解析ECM-myCAF介导的化学保护机制，研究者对从ToC中回收的共培养和单独培养的细胞进行了scRNA-seq分析。结果显示，与ECM-myCAF共培养显著改变了TNBC细胞的转录组。在癌细胞中，与细胞外基质组织、粘附、细胞迁移和凋亡负调控相关的通路被上调。其中，一个关键的凋亡负调控因子G0-G1开关蛋白2（G0S2）的表达在共培养后显著增加。这一发现在患者数据中得到了印证：在化疗前，G0S2在耐药患者肿瘤的癌细胞中表达水平更高。此外，转录因子活性分析表明，SRC家族激酶（SFK）的活性在共培养的癌细胞中显著升高。激酶活性谱分析也证实，与ECM-myCAF共培养后，MDA-MB-231细胞中多种激酶（包括SRC、FAK、EGFR等）的磷酸化水平上升。这些数据共同指向SRC激酶信号通路的激活。
G0S2是ECM-myCAF介导的TNBC化疗耐药的下游关键因子
研究者接着验证G0S2在ECM-myCAF介导的耐药中的功能。蛋白质印迹实验证实，在与ECM-myCAF共培养后，TNBC细胞中G0S2蛋白水平上调。更重要的是，利用siRNA敲低G0S2的表达后，ECM-myCAF赋予的化学保护作用被完全消除，癌细胞的凋亡率恢复到与单独培养相似的水平。这表明G0S2的上调是ECM-myCAF促进TNBC细胞存活的关键下游事件。
ECM-myCAF通过分泌因子激活SRC激酶进而上调G0S2
为了探究SRC激活与G0S2上调之间的关联，研究者在Transwell共培养体系中进行了实验（允许分泌因子交换但阻止直接细胞接触）。结果显示，即使没有直接接触，ECM-myCAF的条件培养基也足以诱导TNBC细胞中SRC的磷酸化（激活）和G0S2蛋白水平的上调。使用SRC抑制剂达沙替尼处理，则可以阻断这种由ECM-myCAF诱导的SRC磷酸化和G0S2表达上调。最后，在ToC模型中使用达沙替尼抑制SRC活性，同样能够完全逆转ECM-myCAF对TNBC细胞的化学保护作用。这些结果揭示了一个清晰的信号轴：ECM-myCAF通过分泌某些因子，激活TNBC细胞中的SRC家族激酶，进而导致凋亡抑制因子G0S2的上调，最终赋予癌细胞对化疗药物的抵抗能力。
讨论
本研究通过结合临床队列分析与先进的离体功能模型，系统性地揭示了一个特定的CAF亚群——ECM-myCAF在三阴性乳腺癌化疗耐药中的核心作用及其分子机制。研究发现，化疗敏感患者肿瘤中ECM-myCAF比例下降，而耐药患者中则维持稳定，这提示ECM-myCAF的持续存在与不良治疗反应相关。利用肿瘤芯片模型，研究者首次在可量化、动态的3D环境中直接证实了原代ECM-myCAF能够保护TNBC细胞免受多柔比星和紫杉醇的杀伤。机制上，该研究阐明了ECM-myCAF通过分泌性信号（不依赖直接接触）激活癌细胞内的SRC激酶，从而上调抗凋亡蛋白G0S2，驱动化疗耐药。靶向该通路（如使用SRC抑制剂或沉默G0S2）能够有效克服这种耐药性。这些发现不仅深化了对肿瘤微环境中特定基质细胞功能异质性的理解，更重要的是，为克服TNBC的化疗耐药提供了新的潜在治疗靶点（如G0S2）和联合治疗策略（如化疗联合SRC抑制剂）。
