胰腺癌是致死率最高的恶性肿瘤之一，胰腺导管腺癌（PDAC）是其最常见的亚型，KRAS基因突变频率高达94%，是关键的驱动因子。尽管靶向KRASG12C的抑制剂已获批用于非小细胞肺癌，但在PDAC中，KRASG12C突变仅占1%，且KRAS抑制剂（KRASi）普遍面临内在与获得性耐药（或复发）的挑战。因此，探索KRASi的耐药机制并发展有效的联合疗法，对于扩展KRAS靶向治疗的疗效至关重要。
为全面评估KRASi耐药的遗传调控机制，研究团队在携带KRASG12D、G12C、G12R和Q61H突变的PDAC细胞系中，针对六种不同作用机制的KRASi，开展了共计12项KRASi锚定的CRISPR-Cas9功能性缺失筛查。筛查鉴定出多个调节KRASi敏感性的基因，其中包括EGFR、CK2、p110α、p110γ和YAP。通过联合靶向抑制剂与KRASi的实验，这些发现得到了验证。一个关键的发现是，KRASQ61H突变型PDAC细胞系在生存上对KRAS的内在依赖性低于其他KRAS突变亚型。此外，EGFR抑制剂厄洛替尼与RAS(ON)多效抑制剂RMC-7977在KRASQ61H突变型PDAC细胞系及EGFR活性高的细胞系中展现出协同效应，其机制在于能够减轻ERK信号的反弹性激活。耐人寻味的是，尽管ERK活性降低，KRASi耐药细胞系仍然表现出对ERK/MAPK通路的持续性依赖。这些发现共同加深了我们对KRASi内在与获得性耐药的理解，并识别出可被潜在利用于胰腺癌患者KRASi联合治疗的新靶点。
KRASi锚定的CRISPR-Cas9 LOF筛查识别出KRASi活性的调控因子
研究使用的KRASi作用机制多样，涵盖共价与非共价抑制剂、“OFF”态SII口袋抑制剂、ON态抑制剂以及OFF/ON抑制剂等，并包括突变选择性抑制剂和“泛”-KRAS或多效抑制剂。研究团队在六株具有不同KRAS突变的PDAC细胞系中，利用六种KRASi的半抑制浓度（GI50）进行了12次筛查，流程持续4至5周。分析结果显示，筛查出的“命中”基因与在KRASG12C抑制剂治疗复发的患者中发现的潜在耐药机制存在重叠。此外，研究还发现了预期的增敏基因（如MAPK1、YAP1、PTPN11）和耐药驱动基因（如NF2、LATS、FBXW7、MST1）。有趣的是，NF1的缺失在不同KRASi类别间表现出差异性调节。筛查终点对存活细胞的分析表明，这些耐药细胞具有升高的EGFR、ERK、Akt活性以及MYC表达，提示EGFR–RAS–ERK MAPK/PI3K–MYC轴在驱动PDAC对KRASi耐药中可能至关重要。
利用正交药理学方法验证筛查命中靶点
基于筛查结果和临床相关性，研究首先验证了EGFR作为靶点。正如预期，厄洛替尼与突变选择性KRASi MRTX1133和adagrasib在多种PDAC细胞系中展现出协同生长抑制。其次，鉴于YAP1缺失是强增敏因子，且上游Hippo通路抑癌基因缺失会驱动耐药，研究测试了YAP/TAZ-TEAD复合物抑制剂IAG933与RMC-7977的联合效果。结果显示，在评估的所有九株KRAS突变型PDAC细胞系中，IAG933均与RMC-7977协同作用，进一步证实了筛查识别临床相关耐药机制的潜力。
厄洛替尼与RMC-7977在PDAC细胞亚群中具有协同效应
尽管传统模型认为，RAS(ON)多效抑制剂（如RMC-7977）已能有效抑制野生型（WT）RAS，理论上与EGFR抑制剂联用可能不会产生额外协同，但筛查数据却显示EGFR缺失在RMC-7977特异性筛查中评分很高。药理学验证发现，厄洛替尼与RMC-7977的联合处理，在一部分PDAC细胞系中确实能引起协同的生长抑制，尤其在KRASQ61H突变型细胞系中效果显著。这表明存在超越传统模型的新协同机制。
KRASQ61H突变型PDAC细胞在药理学和遗传学上对KRAS的依赖性更低
研究发现，KRASQ61H突变型细胞对多种KRASi（包括RMC-7977、BI-2865、AMG 410）的敏感性均较低。这种不敏感性与KRASQ61H独特的生物学特性有关，例如其与SOS1的相互作用存在缺陷，并能作为NF1的抑制剂。遗传学数据也支持这一观点，表明KRASQ61H突变型癌细胞在生存上对KRAS的遗传依赖性低于其他突变亚型，且该突变与较差的预后相关。
野生型RAS通过SOS1依赖性机制在KRASQ61H突变型PDAC中反弹激活ERK
机制探究显示，在KRASQ61H突变型细胞中，RMC-7977处理初期能几乎完全抑制ERK活性，但随后会迅速反弹。这种快速的ERK反弹与HRAS和NRAS活性的补偿性增加相关。遗传学实验证实，敲低SOS1可以完全阻断这种补偿性的WT RAS（HRAS/NRAS） GTP加载，并进一步增敏KRASQ61H突变型细胞对RMC-7977。相反，在KRASG12D突变型细胞中，SOS1敲低并未产生显著的增敏效应。因此，KRASQ61H突变型PDAC细胞对KRASi更耐药，是因为它们对SOS1以及WT HRAS和NRAS的依赖性更高，这与其已知的生物化学特性相符。
联合RMC-7977和厄洛替尼在一部分PDAC细胞系中引致协同增殖缺陷
在KRASQ61H突变型细胞中，联合治疗能有效减轻RMC-7977诱导的ERK反弹，这可能是观察到的协同效应的机制基础。对于表现出协同效应的KRASG12X突变型细胞，研究发现其共同特征是基线EGFR表达和活性水平更高，联合治疗能更有效地降低这些细胞中的活性ERK水平。研究还在患者来源的器官样结构（organoids）中验证了这一发现。当使用作用机制不同的EGFR靶向单抗药物西妥昔单抗时，同样观察到协同效应，尽管其对下游信号通路的影响与厄洛替尼略有不同。
验证CK2作为新型KRASi锚定的CRISPR-Cas9 LOF筛查命中靶点
研究将目光投向具有转化潜力的新靶点。筛查数据显示，编码CK2α‘亚基的CSNK2A2缺失是排名前5%的KRASi增敏基因。药理学验证表明，两种CK2抑制剂SGC-CK2-1和临床候选药物silmitasertib，与MRTX1133或RMC-7977联用，能在广泛的PDAC细胞系中产生普遍的协同生长抑制。机制探索排除了通过影响MYC蛋白稳定性介导协同效应的可能性。进一步的实验提示，CK2的另一个底物LEF1可能部分参与了协同作用的机制，因为LEF1的遗传抑制减弱了CK2i与KRASi的协同效应。
验证PI3K亚型作为新型KRASi锚定的CRISPR-Cas9 LOF筛查命中靶点
筛查同样识别出编码p110γ的PIK3CG缺失是一个增敏基因。药理学实验发现，p110γ选择性抑制剂eganelisib和p110α选择性抑制剂alpelisib分别与RMC-7977联用，都能产生温和至强烈的协同生长抑制。值得注意的是，观察到协同效应所需的抑制剂浓度，可能已经超出了其对特定PI3K亚型的选择性范围，这表明可能需要同时抑制多个PI3K亚基才能有效与KRASi协同，这也与CRISPR完全敲除单一基因的强大效应相呼应。协同作用可能通过共同调控Akt信号通路来实现。
RMC-7977耐药的PDAC细胞发生上皮-间质转化（EMT）并部分依赖ERK MAPK信号
为了探究不具有厄洛替尼+RMC-7977内在协同效应的细胞在获得性耐药后是否会变得依赖EGFR，研究团队构建了一组RMC-7977耐药细胞系。这些耐药细胞对RMC-7977的抗性提高了超过1000倍。与筛查终点观察到的类似，这些耐药细胞也表现出EGFR、ERK、Akt活性以及MYC表达的上调，并发生了明显的上皮-间质转化（EMT），形态上变得更为间质化，且波形蛋白（vimentin）表达增加、E-钙粘蛋白（E-cadherin）表达下降。有趣的是，这些耐药细胞仍然对ERK MAPK信号通路抑制剂敏感。这表明，即使KRAS被持续抑制，这些耐药细胞可能转而通过其他上游信号（如EGFR）来激活和依赖ERK通路以维持生存，为克服耐药提供了新的思路。
