DICER切割准确性由5'-核苷酸身份决定
长期以来，DICER的切割机制，特别是其如何从RNA前体精确加工出长度约为21-22个核苷酸（nt）的小RNA，是RNA干扰（RNAi）和微小RNA（miRNA）生物发生领域的核心问题。传统观点认为，DICER通过测量RNA 5'-端的位置来决定切割位点，即“5'-端计数规则”。一项先前的研究基于冷冻电镜（cryo-EM）结构，提出了一个单一的5'-端结合口袋，该口袋不利于鸟嘌呤（5'-G），可能导致切割不准确。然而，本文的研究挑战了这一观点。
研究团队以pre-mir-517a为模型进行实验，发现将5'-端的胞嘧啶（C）替换为腺嘌呤（A）或鸟嘌呤（G）会显著地将切割偏好转向距离5'-端21个核苷酸的位置（DC21），其中5'-G的效果最为明显。相反，5'-尿嘧啶（U）则倾向于支持在22核苷酸位置（DC22）的切割。这些结果初步表明，5'-G不仅不会降低切割准确性，反而能促进精确的DC21切割。
为了在更广泛的背景下验证这一发现，研究者进行了大规模平行切割实验。他们合成了四组pre-mir-324变体，每组具有固定的5'-核苷酸（A、G、U或C）和随机化的3'-端。对DICER切割产物的高通量测序分析确认，5'-G能产生最高的DC21切割准确性，其次是5'-A，而5'-C和5'-U则偏好DC22。这一系统性结果强有力地证明了5'-核苷酸身份是决定DICER切割位点选择的关键因素。
平行切割实验证实5'-核苷酸的影响
利用pre-mir-324的随机化文库，研究量化了不同5'-末端对切割模式的影响。测序数据显示，DICER主要切割pre-mir-324的DC21和DC22位点。统计分析明确显示，5'-G组的DC21切割比例最高，5'-U组的DC22切割比例最高，而5'-A和5'-C的偏好性介于两者之间。值得注意的是，在此实验体系中，随机化的3'-末端核苷酸对切割位点选择没有可检测的影响，进一步凸显了5'-端的主导作用。
5'-核苷酸的作用在其他前体miRNA中得到验证
为了检验5'-核苷酸效应的普适性，研究者在其他天然pre-miRNA背景（如pre-mir-629和pre-mir-208a）中进行了验证。在天然具有5'-U的pre-mir-629中，DICER在DC21和DC22位点均有切割。当将其5'-U突变为5'-A后，DC22切割减少，证实5'-U确实增强了DC22切割。同样，在天然具有5'-G的pre-mir-208a中，DICER主要进行DC21切割；将其5'-G变为5'-U后，切割则转向DC22。这些结果在多种pre-miRNA背景下一致地表明，5'-G促进DC21切割，而5'-U促进DC22切割。
冷冻电镜揭示DICER与5'-G和5'-U shRNA的结合结构
为了从结构上理解5'-G和5'-U如何影响切割特异性，研究团队解析了人源DICER分别与含有5'-G（26S-GU）或5'-U（26S-UG）的短髮夹RNA（shRNA）复合物的冷冻电镜结构，分辨率分别达到3.37埃和3.34埃。这两种shRNA都含有已知能引导DC22切割的RNA基序（mWCU和YCR）。复合物结构显示，RNA被完全锚定在由RIIIDa和RIIIDb结构域形成的催化中心，钙离子的存在证实了复合物处于“切割就绪”的构象。
dsRBD和PAZ结构域的构象变化
结构比较揭示了DICER在结合RNA和切割过程中发生的显著构象变化。与已报道的apo-DICER结构以及DICER–pre-let-7a-1GYM复合物结构相比，本研究中与shRNA结合的DICER结构整体更加紧凑。这种紧凑性主要由PAZ结构域向内移动约7.4埃所驱动，同时双链RNA结合域（dsRBD）也向DICER的长轴方向移动了约5埃。这些协同运动像“筷子”一样夹住并调整RNA底物，使其两条链的切割位点都能与催化中心精确对齐，从而有利于高效的双链切割。表面积埋藏分析显示，这种“内收模式”显著增加了RNA与DICER之间的接触面积。
3'-端结合口袋结构的保守性
在两种复合物结构中，3'-末端核苷酸都稳定地结合在一个保守的口袋中，该口袋位于PAZ结构域，由一组保守的酪氨酸（Y936, Y971, Y972, Y976）和碱性残基（R937, K975）组成，用于识别3'-末端的磷酸二酯键。这与之前多项研究的结果一致，证实了DICER及其同源蛋白中3'-端识别机制的保守性。结构显示，没有残基与3'-末端核苷酸的碱基发生特异性相互作用，这解释了为何3'-核苷酸身份对切割位点选择影响较小。
发现一个5'-G偏好性结合口袋
与保守的3'-端口袋不同，5'-末端在DICER–26S-UG和DICER–26S-GU结构中展示了截然不同的结合模式。在DICER–26S-UG结构中，5'-U位于先前已识别的“U偏好性口袋”中，其碱基与R821相互作用，5'-磷酸与R1003结合。然而，在DICER–26S-GU结构中，研究者发现了一个全新的“G偏好性口袋”。在这里，5'-G的碱基与D991形成氢键，其5'-磷酸则与H992结合。D991和H992共同创造了一个对鸟嘌呤有选择性的微环境。与5'-U的结合相比，5'-G的结合使RNA骨架沿着发夹的下部茎干向上移动了大约一个核苷酸的距离。在RNA上段序列相同的情况下，这一移动使得对于5'-G底物，DC21位点被定位在催化中心；而对于5'-U底物，则是DC22位点被定位。这从结构上解释了5'-核苷酸身份如何决定切割位点的选择。
5'-G结合口袋的功能验证
为了验证5'-G结合口袋的功能重要性，研究者对关键残基D991和H992进行了突变（D991G, H992G, D991G/H992G）。体外切割实验表明，这些突变显著降低了具有5'-G的pre-miRNA（如pre-mir-517a_GU）的DC21切割效率，但对具有5'-U的pre-miRNA的DC22切割没有影响，证明了这些残基对5'-G口袋功能的特异性至关重要。在细胞实验中，在DICER敲除的HCT116细胞中重新表达野生型DICER或D991G/H992G双突变体，并转换pre-mir-517a_GU，小RNA测序结果显示，与野生型相比，突变体产生的DC21产物减少，进一步在体内证实了D991和H992的作用。
研究者还解析了DICER(D991G/H992G)突变体与26S-GU的复合物结构。在该结构中，由于关键结合残基的缺失，5'-G不再稳定结合于G偏好性口袋，而是倾向于与其配对的U保持碱基配对，并轻微移向5'-U口袋的方向，但并未与R821或R1003形成类似5'-U的相互作用。这为D991和H992在形成5'-G结合口袋中的核心作用提供了进一步的证据。
5'-G结合口袋在物种间具有保守性
序列分析表明，构成5'-G口袋核心的D991和H992在多个物种的DICER酶中是保守的。对果蝇Dcr-1（人DICER的同源蛋白）进行的大规模平行切割实验也显示出类似的切割特异性：5'-G促进DC21切割，5'-U偏好DC22切割。此外，对不同物种中具有不同5'-末端的前体miRNA所产生的成熟miRNA长度进行分析发现，5'-G前体产生最多DC21长度的miRNA，而5'-U前体产生最多DC22长度的miRNA。这些发现表明，DICER通过G偏好性口袋（促进DC21）和U偏好性口袋（促进DC22）进行5'-末端识别的“双口袋模型”是一个在进化上保守的机制。
5'-端计数规则与RNA基序规则的协调
在DICER–26S-UG结构中，5'-U（倾向于DC22）与shRNA中存在的mWCU–YCR基序（也引导DC22切割）的方向一致，因此协同作用导致精确的DC22切割。然而，在DICER–26S-GU结构中存在冲突：5'-G（通过G偏好性口袋引导DC21）与mWCU–YCR基序（引导DC22）的指令相反。尽管存在初始的错配，实验表明26S-GU最终仍然在DC22位点被切割。为了理解DICER如何解决这种冲突，研究者比较了DICER–26S-GU和DICER–26S-UG的蛋白结构，发现整体结构几乎相同，仅在5'-端结合口袋、PAZ结构域和RIIIDa中靠近3'切割位点的一个螺旋等局部区域有细微调整，表明冲突的解决主要依赖于局部的重排而非大规模的构象变化。
关键的机制在于RNA自身的构象调整。结构分析发现，在DICER–26S-GU复合物中，RNA骨架发生了比在DICER–26S-UG中更显著的扭曲。特别是，dsRBD中的R1855与mWCU基序中的19-CC错配发生相互作用，这种基序驱动的相互作用对RNA骨架施加了寄存器特异性的张力。在26S-GU中，为了在5'-G将骨架定位在DC21的情况下，仍能实现mWCU基序与R1855的接触并将DC22对齐到催化中心，RNA骨架被迫发生了更大的扭曲。这种由RNA基序诱导的构象变化能够覆盖5'-G规则的初始指令，最终确保在DC22位点进行切割。对人类pre-miRNA的统计分析也支持这一模型：尽管5'-G前体通常产生更多DC21 miRNA，但仍有相当一部分产生了DC22 miRNA，而这部分中很多在DC22位点含有YCR基序；反之，一些产生DC21 miRNA的5'-U前体则在DC21位点含有YCR基序。这说明了强效的RNA基序可以覆盖5'-端计数规则来决定切割位点。
DICER对5'-G前体miRNA的切割结构
为了在更天然的pre-miRNA背景下验证5'-G口袋促进DC21切割的作用，研究者解析了DICER与pre-mir-517a_GU（在该背景下发生DC21切割）的复合物结构。获得了“切割前”和“切割就绪”两种状态的结构。在切割就绪状态结构中，末端的G–U对未配对，5'-G占据着与26S-GU中相同的口袋，并与D991和H992相互作用。值得注意的是，在pre-mir-517a_GU中，位于第17位的mWCU基序也倾向于DC21切割，因此5'-G规则和基序规则相互强化，共同指向DC21位点。相应地，在该结构中并未观察到像26S-GU中那样明显的RNA骨架扭曲，因为不存在规则冲突。
讨论
本研究重新定义了DICER的5'-端结合模型。不同于此前认为存在单一且不利于5'-G的口袋的观点，本研究发现了两个独立的5'-端结合口袋：一个G偏好性口袋（由D991和H992形成）引导DC21切割，一个U偏好性口袋（由R1003和R821稳定）引导DC22切割。A和C表现出中等的选择性。这种双口袋机制解释了切割寄存器选择的多样性，并使得根据5'-末端身份预测切割位点成为可能。
结构研究还揭示了PAZ结构域和dsRBD显著的构象变化，这对于将RNA精确定位到催化中心至关重要。本研究中观察到的“内收模式”增加了复合物的接触面积，优化了切割位点的对齐。相比之下，某些RNA底物可能需要RNA螺旋的扩展来补偿次优的对齐。
研究发现5'-核苷酸是决定DC21与DC22切割的关键因素，而RNA基序（如mWCU和YCR）可以强化或对抗5'-端的指令。DICER通过整合这些有时相互竞争的信号来实现精确切割，其中涉及RNA骨架的局部构象调整。当规则冲突时（如5'-G与指向DC22的mWCU–YCR基序），基序驱动的RNA构象变化可以覆盖5'-端的初始偏好。
该双口袋架构在动物中具有进化保守性。5'-G口袋的发现为shRNA设计提供了新见解。由于RNA聚合酶III转录的shRNA通常在第一核苷酸处掺入G，这一特性会使其倾向于DC21切割。通过协调RNA元件（如茎干长度）和序列基序来增强DC21产物的产生，可以优化细胞中DICER的加工，从而提高shRNA的基因沉默效率。总之，这项工作推进了我们对DICER切割保真度机制的理解，揭示了其整合双重5'-端结合口袋、RNA基序影响和结构域运动的复杂工作方式。
