引言：小胶质细胞在阿尔茨海默病中的核心角色
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种复杂的多因素疾病，其进展涉及神经炎症和小胶质细胞的参与。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，虽然在脑细胞总数中仅占约10%，但其在AD病理进程中，从最早期阶段就发挥着关键作用。随着疾病的进展，小胶质细胞从最初旨在清除有害Aβ斑块的“启动”状态，逐渐转变为慢性活化甚至功能失调的状态。在体内捕获AD不同临床阶段的小胶质细胞状态，对于开发旨在调节小胶质细胞功能以阻止AD进展的新疗法至关重要。
近年来，脑脊液（CSF）蛋白质组学和单细胞转录组学取得了重大进展。体外小胶质细胞的转录组学研究揭示了疾病相关的异质性表型，包括在AD脑活检、尸检组织和实验模型中发现的疾病相关小胶质细胞（Disease-Associated Microglia, DAM）表型。这些DAM表型已被证明具有时间异质性，这可能反映在脑脊液中分泌蛋白水平的异常变化上。脑脊液是评估AD病理的宝贵体内替代指标。此外，有假说认为AD中的小胶质细胞活化呈现两个高峰：早期的保护性高峰和晚期的促炎性高峰。整合单细胞转录组学和蛋白质组学数据，可能揭示AD连续谱不同阶段脑脊液中反映的小胶质细胞特征。
研究设计与方法概览
本研究整合了可用的转录组学数据集与通过邻位延伸分析技术（Proximity Extension Assay, PEA）获得的高通量脑脊液蛋白质组学数据。研究队列涵盖了从认知未受损对照、临床前期AD到AD痴呆的整个临床谱系。从这些蛋白质组学数据中，通过与小胶质细胞的单细胞和批量转录组学数据集比对，筛选出155个与小胶质细胞相关的蛋白进行分析。研究旨在识别和独立验证跨AD临床阶段的小胶质细胞相关蛋白特征，评估它们如何转化为脑脊液中反映的转录组学小胶质细胞表型，并应用分类模型来明确一组能够区分临床前期AD和晚期症状性AD的蛋白。此外，还评估了年龄效应、AD特异性（与其他痴呆类型相比）以及使用正交蛋白质组学技术（串联质量标签质谱法，TMT-MS）的可重复性。
结果一：AD临床前期阶段特异性上调的脑脊液蛋白（“早期特征”）
蛋白质组学分析在临床前期AD组中识别出7个特异性上调的蛋白，包括APP、VEGFA、ADGRE5 (CD97)、LDLR、IFNLR1、PLAT和KYNU。与对照组和痴呆期相比，这些蛋白仅在临床前期AD阶段显著升高。功能富集分析显示，这些蛋白与多种炎症和免疫过程、防御和创伤反应、趋化性和信号传导相关。从亚细胞定位来看，APP、ADGRE5、LDLR和IFNLR1是跨膜受体；VEGFA和PLAT是分泌蛋白；KYNU是胞质蛋白。这些蛋白均与小胶质细胞功能相关，可能激活小胶质细胞。此外，与内吞作用和胞吐作用相关的过程也得到富集，这可能突出了神经胶质功能和监视作用。然而，当将这些蛋白与小胶质细胞转录组图谱中的特征进行比对时，没有发现任何明确的转录特征专门对应于这个“早期特征”。总体而言，基因本体论分析和与小胶质细胞特征的关联表明，在临床前期AD阶段特异性升高的蛋白可能总体上反映了细胞募集增加、广泛的免疫过程激活以及用于监视的运动性增强。
结果二：AD痴呆阶段特异性上调的脑脊液蛋白（“晚期特征”）
第二个蛋白质组学特征揭示了9个在AD痴呆阶段特异性上调的蛋白，包括CCL2 (MCP-1)、CTSH、CXCL8 (MCP-2)、IL-18、CCL8 (MIF-1α)、CD300LF (CLM-1)、CEACAM1、MARCO和IL-1RN。与对照组和临床前期AD阶段相比，这些蛋白仅在AD痴呆阶段显著升高。功能富集分析揭示了与“早期特征”相似的过程，但有更多蛋白富集于先天性和体液免疫以及细胞因子信号传导。从这9个蛋白来看，CCL2、CTSH、CXCL8、IL-18和CCL8是分泌型趋化因子和细胞因子，而CD300LF、CEACAM1、MARCO和IL-1RN则作为跨膜蛋白或存在于细胞质中。当与小胶质细胞转录组图谱进行比对时，只有两个蛋白（CCL2和CTSH）与小胶质细胞特征重叠：CCL2与干扰素1（IFN-1）反应和趋化因子特征相关，而CTSH与抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cell, APC）特征（HLAhigh）相关。这意味着也没有明确的小胶质细胞特征可被专门归因于“晚期特征”。综合来看，这些发现表明，与疾病早期阶段相比，AD痴呆阶段的免疫反应有所增加，同时促炎活性和细胞死亡相关蛋白也增多。
结果三：在临床前期AD阶段失调并持续至AD痴呆阶段的脑脊液蛋白（“持续特征”）
第三个蛋白质组学特征包含了93个蛋白，它们在临床前期AD阶段相较于对照组即已显著上调，并且这种变化持续到AD痴呆阶段。大多数这些蛋白（67个）是跨膜蛋白，24个是分泌蛋白，8个是胞质蛋白，2个是高尔基体蛋白，1个是线粒体蛋白。功能富集分析指出了与多种免疫和跨膜蛋白的关联，特别是细胞凋亡过程以及适应性、体液和先天性免疫系统过程，连同细胞因子信号传导得到富集，这符合上述针对疾病阶段的独特特征的组合。值得注意的是，这93个蛋白中有44个与小胶质细胞图谱中指定的特征重叠，突显了总共20个蛋白中有14个（70%）属于疾病相关特征（GPNMBhigh和 APOEhigh），总共8个中有5个（62.5%）属于稳态特征（CX3CR1high），总共26个中有17个（65%）属于炎症特征（免疫调节、趋化因子和IFN-1反应），总共9个中有6个（67%）属于抗原呈递特征（HLAhigh/APC 和 C1Qhigh/吞噬性），总共16个中有9个（56%）属于先天性免疫特征（IL/IFNγ 和 S100/TLR信号），总共14个中有10个（71%）属于应激和衰老特征等。综合来看，绝大多数改变的蛋白都落在这个特征中，这表明在两个阶段中小胶质细胞活性都经历了深刻的上调，并且这并不仅限于脑脊液中反映的特定小胶质细胞亚型。
结果四：区分临床前期AD与AD痴呆阶段的脑脊液蛋白分类
在识别了跨AD疾病阶段的三个蛋白质特征之后，研究进一步聚焦于提炼一组能够捕捉从临床前期AD进展到AD痴呆过程中所发生变化的蛋白。分类分析确定了18个蛋白，其丰度模式最能区分早期和晚期临床AD阶段，并可能最好地反映变化的生物学过程。这18个蛋白中，有15个（ADAM23、ADGRE5、APP、AXL、CHL1、CXADR、IFNGR1、IL17RA、LAIR1、RELT、ROBO2、SCARF1、SPRY2、TNFRSF14、VEGFA）在早期和晚期阶段呈下降趋势，而另外3个（CCL2、CCL3、CTSC）则呈上升趋势。这些蛋白来源于上述三个特征：“早期特征”（ADGRE5、APP、VEGFA）、“晚期特征”（CCL2），其余则属于“持续特征”（ADAM23、AXL、CHL1、CXADR、IFNGR1、IL17RA、LAIR1、RELT、ROBO2、SCARF1、SPRY2、TNFRSF14、CCL3、CTSC）。
为了初步了解这些蛋白是否以协调的方式影响小胶质细胞过程，研究进行了蛋白-蛋白相互作用的STRING分析。该分析突出了CCL2、CCL3和VEGFA作为所分类蛋白之间连接枢纽的作用。这些蛋白的功能分析显示，它们在神经元、免疫反应、细胞信号传导和凋亡过程中具有广泛功能。在晚期阶段增加的蛋白包括两个促炎趋化因子和一个参与免疫调节的蛋白酶，这表明向慢性免疫激活和潜在蛋白功能障碍的转变。相比之下，15个下降的蛋白主要是免疫受体或受体信号通路蛋白，这可能表明在疾病后期阶段的细胞通讯减少。
结果五：年龄效应、AD特异性与技术特异性
作为AD的主要风险因素
