摘要
细胞膜是动态屏障，但其脂质成分易受氧化损伤，发生脂质过氧化。这一过程会破坏膜完整性并执行铁死亡——一种与癌症、神经退行性疾病和缺血再灌注损伤等多种（病理）生理过程相关的调节性细胞死亡。铁死亡主要由谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抑制，其利用谷胱甘肽还原磷脂氢过氧化物。此外，泛醌（CoQ10）、维生素E和维生素K等自由基捕获抗氧化剂在抑制脂质过氧化传播中也至关重要。近年来，铁死亡抑制蛋白1（FSP1）已成为抵抗铁死亡的关键角色。与GPX4不同，FSP1利用NAD(P)H作为电子供体，再生泛醌和维生素K等醌类抗氧化剂，从而阻止铁死亡执行所需的自由基链式反应。尽管FSP1的酶学机制已较为明确，但调控其功能的可操作因素在很大程度上仍未被阐明。识别这些调控因子对于理解细胞如何维持膜氧化还原稳态以及抵抗应激诱导的铁死亡至关重要，并可能为铁死亡起重要作用的病理状况揭示治疗策略。
结果
聚焦CRISPR筛选揭示FSP1的调控因子
研究者之前证明，缺乏GPX4的细胞在FSP1活性强劲时（无论是通过天然高表达的FSP1还是强制过表达）可以存活并无限增殖。基于此，他们在过表达FSP1的背景中敲除了GPX4，构建了FSP1依赖型的HT1080细胞。这些细胞在FSP1被抑制时容易发生细胞死亡，而这种死亡可以被铁死亡抑制剂liproxstatin-1所挽救。
研究者认为，该细胞模型可与基于CRISPR的基因筛选相结合，以识别影响FSP1功能的因子。因此，他们进行了一项聚焦CRISPR筛选，比较了在有或没有liproxstatin-1条件下的情况。通过这种方法，他们发现了几个基因的缺失会显著影响FSP1依赖的铁死亡抵抗，其中两个最重要的靶点是编码硬脂酰辅酶A去饱和酶-1的SCD1和编码核黄素激酶的RFK。已知SCD1的缺失会通过提高多不饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸的比例来增加铁死亡敏感性。与之一致，SCD1的药理抑制很容易在FSP1依赖型细胞中引发铁死亡。这些发现表明，具有高多不饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸比例的细胞从FSP1活性中获益有限。
鉴于这些结果，研究者将重点放在RFK及其调控FSP1的作用上。RFK是磷酸化核黄素以产生黄素单核苷酸的关键酶，这是生成黄素腺嘌呤二核苷酸的核心步骤，而FAD是FSP1等黄素蛋白活性必需的辅因子。FSP1对FAD的依赖性意味着与RFK存在直接联系，但RFK缺陷在多大程度上影响FSP1水平和铁死亡抵抗尚不清楚。在使用A375细胞的研究中，他们发现CRISPR介导的RFK敲除导致RFK表达的强烈缺失和FSP1蛋白水平的下降。这种降低使得RFK缺陷细胞对GPX4抑制剂高度敏感，突显了铁死亡抵抗对RFK的先前未知的依赖性。他们在HT1080 FSP1依赖型细胞中也得到了类似的结果。这些发现确立了RFK是FSP1功能和铁死亡抵抗的一个可操作的上游调控因子。
FAD缺陷破坏FSP1功能并促进铁死亡易感性
有趣的是，研究者观察到，在RFK缺陷细胞中，对GPX4抑制剂敏感性的增加会随时间推移而消失。FAD生物合成是一个多步骤过程，始于核黄素通过SLC52A家族溶质载体成员的摄取。进入细胞后，核黄素被RFK磷酸化生成FMN，随后FMN被黄素腺嘌呤二核苷酸合酶腺苷化以产生FAD。与之一致，DepMap数据库分析显示，大多数细胞类型难以耐受RFK的缺失。这种不耐受性在他们的培养物中也很明显，未编辑的细胞迅速在竞争中胜过RFK缺陷细胞。这些挑战阻碍了进一步的实验，并促使他们探索是否可以靶向其他生成黄素辅因子的酶。
值得注意的是，与RFK不同，负责FAD生物合成最后一步的FADS酶的缺失似乎能被细胞更好地耐受，可能是因为必需的FMN依赖性蛋白质仍保持功能。因此，他们在A375细胞和HT1080 FSP1依赖型细胞中敲除了FADS，并生成了相应的单克隆细胞系，从而建立了一对同基因的FADS充足和缺陷细胞系。使用这个模型，他们发现FADS的缺失导致对GPX4抑制的敏感性显著增加，以及对脂质过氧化的敏感性增加。他们在HT1080 FSP1依赖型模型中也观察到了类似的效果。
黄素辅因子的缺失会损害黄素蛋白质组的稳定性并产生广泛的代谢效应，包括影响脂质代谢。因此，他们旨在确定这种效应（氧化还原稳态的丧失）是否是FSP1特异性的，还是更普遍。对FADS同基因对的整个蛋白质组分析证实了黄素蛋白丰度的降低。然而，有趣的是，FSP1和NQO1是FADS缺陷细胞中减少最显著的黄素蛋白，这种效应与信使RNA丰度无关。基于这一观察，他们在其他细胞系中验证了该效应，表明FADS的遗传缺失导致FSP1的大量丢失，并伴随着铁死亡敏感性的增加。FSP1在有和无FAD情况下的分子动力学模拟表明，FAD的缺失增加了蛋白质主链的不稳定性。均方根涨落曲线揭示了更显著的残基波动，尤其是在与FAD相互作用的第282-300位残基。总的来说，这些发现确立了FAD不仅对活性至关重要，而且对FSP1的稳定性也至关重要。
利用遗传和药理学方法，他们发现在FADS缺陷细胞中敲除或抑制FSP1不会进一步增加由GPX4抑制剂引起的脂质过氧化和铁死亡的敏感性。最后，FADS的缺失似乎特异性地使细胞对GPX4抑制剂敏感，而其他铁死亡诱导剂（如erastin和L-丁硫氨酸-亚砜亚胺）或其他测试的具有多种作用机制的细胞毒性剂，在FADS缺失的情况下没有表现出增强效应。这些发现确立了FADS是FSP1活性和铁死亡敏感性的关键调控因子。
核黄素可用性是铁死亡抵抗的核心决定因素
在确立了细胞内黄素代谢通过FSP1与铁死亡抵抗之间的功能联系后，研究者假设核黄素（FAD的主要前体）的可用性可以影响铁死亡敏感性。为了验证这一点，他们检测了在核黄素缺乏条件下培养的细胞的蛋白质组变化。与FADS缺陷细胞一样，他们观察到黄素蛋白的整体减少。然而，这些变化似乎更为广泛，大概是因为含FMN的蛋白质也受到了影响。值得注意的是，FSP1在核黄素剥夺96小时后成为下调最显著的蛋白质之一，突显了FAD在FSP1稳定性中的关键作用。核黄素剥夺还伴随着NRF2靶基因的上调。
在无核黄素条件下培养细胞72小时显著增加了它们对脂质过氧化的易感性，并增强了在GPX4抑制下的细胞死亡。这些效应不仅限于A375细胞，来自不同组织来源的另外三种癌细胞系也表现出类似的反应。与FSP1依赖机制一致，在核黄素充足条件下，GPX4抑制剂与FSP1抑制剂联用强烈地使细胞敏感，但在缺乏核黄素的情况下影响甚微。他们在FSP1缺陷的A375和MDA-MB-231细胞系中进一步证实了这些效应。在GPX4抑制下，只有在用核黄素培养的细胞中，FSP1的缺失才会导致进一步的铁死亡敏感性增加。这些结果在HT1080 FSP1依赖型和A375细胞中得到了重现，其中主要核黄素转运蛋白SLC52A2的基因敲除破坏了FSP1功能并使细胞对GPX4抑制剂敏感。这些发现表明，在核黄素缺乏的条件下，细胞主要通过FSP1依赖途径变得对铁死亡敏感。
为了直接证明核黄素支持对脂质过氧化的保护，他们分析了在核黄素充足和缺乏条件下用GPX4抑制剂处理的细胞的外脂质组。详细分析显示，在核黄素饥饿的细胞中，GPX4抑制后氧化磷脂酰乙醇胺物种迅速且特异性积累。重要的是，用liproxstatin-1处理完全逆转了氧化脂质的形成。总之，这些结果确立了核黄素与膜抗氧化能力之间的直接联系。
考虑到他们在核黄素耗竭条件下的结果，研究者接下来探究了核黄素浓度的适度变化是否同样会影响对GPX4抑制剂的敏感性。值得注意的是，人血浆核黄素浓度通常在10到20 nM之间，而标准细胞培养基含有高得多的核黄素。他们发现生理水平的核黄素显著降低了FSP1的表达，而浓度高于100 nM就足以稳定FSP1并赋予铁死亡抵抗。总之，他们的研究表明，核黄素的可用性是膜修复能力的核心决定因素，并决定了FSP1抗氧化剂再生能力。
核黄素类似物破坏FSP1活性并促进铁死亡
他们的结果表明，药理靶向核黄素代谢以破坏其FSP1保护分支，将使癌细胞对铁死亡敏感。目前尚未描述针对核黄素摄取或作用于FMN和FAD的任何蛋白质的选择性抑制剂。然而，链霉菌属细菌产生的核黄素抗代谢物玫瑰黄素，通过与核黄素核糖开关结合并破坏其功能而发挥抗菌活性。玫瑰黄素作为一种广谱抗生素显示出前景，但很少有研究探索其作为抗癌剂。在真核细胞中，玫瑰黄素被认为遵循与核黄素类似的代谢途径，被转运、磷酸化和腺苷化。异咯嗪环C8上的二甲基氨基导致形成一种改变的黄素辅因子，据信会破坏正常的黄素介导的电子转移反应。
使用HT1080 FSP1依赖型细胞，他们研究了玫瑰黄素是否影响FSP1介导的铁死亡保护。值得注意的是，在生理相关水平的核黄素下，玫瑰黄素在个位数纳摩尔范围内就诱导了铁死亡。此外，玫瑰黄素仅影响表达FSP1的细胞对GPX4抑制剂的反应，而在FSP1缺陷细胞中未检测到增敏作用，表明玫瑰黄素的作用是特异性的。另外，当细胞在低生理核黄素条件下处理时，玫瑰黄素恢复了FSP1水平，表明其作用可能是靶向性的。玫瑰黄素的作用在更大的细胞系面板中得到了广泛重现，处理可以恢复FSP1水平。这些作用反映了玫瑰黄素腺嘌呤二核苷酸像FAD一样能够稳定FSP1；然而，异咯嗪基团的修饰破坏了其氧化还原酶功能。
最后，他们探索了玫瑰黄素的作用机制。为此，他们首先生成了稳定表达对照或FSP1-Flag的A375细胞，并进行免疫沉淀实验以分离和纯化Flag标记的蛋白质。成功纯化后，他们在无细胞系统中测量了酶活性，使用NADH作为电子供体，并通过荧光监测刃天青还原来跟踪FSP1活性。重要的是，在对照条件下没有活性，并且信号被FSP1抑制剂消除，从而证实了检测的特异性。
为了评估玫瑰黄素是否可以被代谢、掺入FSP1并调节其活性，他们结合了建模和功能实验。FSP1与辅因子FAD、6-OH-FAD和玫瑰黄素腺嘌呤二核苷酸的分子动力学模拟表明，玫瑰黄素腺嘌呤二核苷酸与FSP1结合，但所得复合物似乎不太稳定。接下来，他们通过将细胞核黄素饥饿72小时，然后用核黄素或玫瑰黄素重新喂养，来检查功能结果。正如预期，黄素饥饿使FSP1不稳定，而用任一种化合物补充都能稳定蛋白质，证实它们转化为FAD或玫瑰黄素腺嘌呤二核苷酸并正确掺入酶中。引人注目的是，免疫沉淀实验表明，尽管玫瑰黄素补充稳定了FSP1，但该酶在催化上没有活性，这与核黄素恢复的活性形成对比。
他们还扩展了蛋白质组学分析，并证实了在核黄素剥夺96小时后，用核黄素或玫瑰黄素重新喂养细胞，FSP1和其他黄素蛋白的表达得以恢复。值得注意的是，一些与应激反应相关的蛋白质在玫瑰黄素处理的细胞中仍然上调，这表明玫瑰黄素衍生的代谢物可以稳定一些黄素蛋白，但未能恢复其全部功能和黄素稳态。
同时，他们通过细胞分选和荧光分析证实，玫瑰黄素在核黄素缺乏条件下培养的A375细胞中恢复了FSP1-GFP的表达。值得注意的是，用MG132抑制蛋白酶体可防止在缺乏黄素辅因子时FSP1的丢失。
异咯嗪环上的取代已知会显著改变黄素氧化还原性质。环电子密度的这些变化为玫瑰黄素腺嘌呤二核苷酸稳定但使FSP1失活提供了一个合理的解释。基于此，他们假设玫瑰黄素腺嘌呤二核苷酸内的电子流将不太有利。由于玫瑰黄素腺嘌呤二核苷酸无法商业获得，他们无法直接测量其反应性，但他们分析了玫瑰黄素腺嘌呤二核苷酸前体玫瑰黄素的反应性，其保留了异咯嗪环。监测340 nm处的NADH氧化显示，核黄素而非玫瑰黄素氧化了NADH。类似地，只有核黄素促进了刃天青的还原。尽管这些检测是在水溶液中进行的，必须谨慎解释，因为蛋白质环境可以进一步调节黄素的氧化还原电位，但这结合起来的证据支持了一种机制，即玫瑰黄素衍生的代谢物掺入FSP1，但不能从NAD(P)H接受电子，从而使酶失活。
总之，这些结果表明，FSP1活性可以被核黄素抗代谢物有效抑制，为靶向癌细胞中的铁死亡保护机制提供了额外的机会。
讨论
研究者揭示了核黄素通过FSP1调控铁死亡的关键作用。先前的研究确立了FSP1是抵抗脂质过氧化的基本保障，补充了GPX4的活性；然而，调控FSP1功能的上游因素在很大程度上仍未知。通过系统解析FAD生物合成，他们证明核黄素-FMN-FAD途径中的多个节点直接影响FSP1的稳定性及其再生脂溶性抗氧化剂的酶促能力。FAD辅因子对于FSP1的结构稳定至关重要，其缺失会导致错误折叠并最终通过泛素-蛋白酶体途径降解。E3连接酶RNF8似乎参与了泛素-蛋白酶体途径对脱辅基FSP1的降解。特别是，他们强调了FADS是FAD生成最后一步的关键酶，并揭示其缺失特异性地损害FSP1，对铁死亡敏感性和细胞存活具有广泛影响。这些发现增强了我们对细胞如何依赖核黄素代谢在氧化应激下保持膜完整性的理解。
至关重要的是，他们观察到标准组织培养培养基提供的核黄素浓度远超过生理血浆水平，这可能掩盖了影响核黄素可用性并最终影响铁死亡敏感性的遗传和非遗传因素的影响。在生理或核黄素缺乏条件下培养细胞揭示了FSP1表达和铁死亡结果的显著变化，强调核黄素的适度波动可以改变氧化还原平衡。因此，体外核黄素浓度与人血浆浓度之间的差异对于转化研究高度相关，因为体内核黄素可用性较低可能会减弱FSP1介导的铁死亡保护。这一见解对机制研究和潜在的临床背景提出了重要考量，在这些背景中，饮食核黄素或改变的代谢可能驱动对铁死亡相关疾病的易感性。
有趣的是，可以在核黄素对FSP1的调控与硒对GPX4的调控之间进行类比。众所周知，硒的可用性决定了GPX4的蛋白质翻译，硒代谢途径作为铁死亡的潜在调节因子引起了极大兴趣。类似地，他们的发现表明，核黄素（作为FAD的前体）决定了FSP1的丰度和活性，且独立于mRNA水平。重要的是，GPX4和FSP1都强调了理解铁死亡这两个关键调控因子不能仅通过分析其mRNA的丰度。相反，需要特定的微量营养素（GPX4需要硒，FSP1需要核黄素）才能实现其正确的翻译和功能。这确立了一个更广泛的原则，即微量营养素及其代谢途径调节蛋白质功能和铁死亡易感性，为治疗干预提供了重要机会。
除了阐明内源性核黄素代谢的作用外，他们还强调了核黄素抗代谢物（如玫瑰黄素）作为FSP1功能有效调节剂的价值。由于其结构与核黄素相似，玫瑰黄素可能具有高效的组织分布，并在生理相关核黄素浓度下表现出纳摩尔级的活性，远低于当前的FSP1抑制剂。玫瑰黄素的另一个优势在于其摄取和代谢依赖于SLC52A2、RFK和FADS。可能影响耐药性的这些蛋白质的突变也会损害核黄素的摄取和代谢，最终阻止FAD和FMN等必需辅因子的产生。这种双重影响使得细胞不太可能选择性地对玫瑰黄素产生耐药性而不严重损害核黄素代谢和FAD生成。相比之下，FSP1的特异性抑制剂更容易产生耐药机制，例如FSP1本身的突变或补偿途径的激活，因为这些不会破坏更广泛的代谢网络。玫瑰黄素对必需且保守的代谢途径的依赖因此可能提供重要的治疗优势。
总之，他们的结果表明，细胞内黄素代谢对于FSP1抵抗磷脂过氧化的保护功能至关重要，其作用独立于GPX4。这一框架构成了一个先前未被充分认识的增强铁死亡的方法，适用于FSP1支持存活的其他背景，如癌症。此外，他们的工作揭示了核黄素在FSP1驱动的脂溶性抗氧化剂再生中的作用，为营养物质的复杂相互作用提供了基本见解，对理解抗氧化剂疗法在临床前和临床研究中结果不一致具有重要意义。
